Методы исследования макромолекул © Karabelsky A.V

ОБЩАЯ биохимическая стратегия исследования макромолекул Получение ОБЪЕКТА исследования (бактерии, дрожжи, клетки тканей) Обработка объекта исследования (лизис, разрушение, измельчение) Выделение нужной фракции или нужной макроструктуры (мембраны, органеллы, ядро, рибосомы, микросомы, цитоплазмы и др.) Обработка препарата. Выделение фракции белков (липидов, ДНК, РНК и т.д.) Детекция нужной молекулы Выделение и очистка нужной молекулы ЭКСТРАКЦИЯЭКСТРАКЦИЯ © Karabelsky A.V

1. Получение объекта исследования -Культивирование бактерий и дрожжей внеобходимых условиях. Сбор клеток осуществляется центрифугированием или фильтрацией. -Получение ткани животного, человека (или использование культур клеток). © Karabelsky A.V

Центрифугирование Клетки хорошо седиментируются при незначительных значениях g. В лабораторных условиях достаточно 5000 об/мин минут – чтобы все клетки оказались на дне пробирки. © Karabelsky A.V

2. Обработка объекта. © Karabelsky A.V

Основные типы обработкки. Гомогенизатор Поттера Ферментативный лизис Механическое разрушение замороженных тканей (размолом или с помощью вращающихся ножей; под большим давлением; осмотическим шоком; многократным чередованием замораживания и оттаивания ) © Karabelsky A.V

Лизис клеток бактерий (распространенный способ) 1.Добавляют к клеткам лизоцим, ЭДТА в растворе сахарозы растворение наружных мембран. Мембраны превращаются в сферопласты (только внутренняя мембрана) 2.Гомогенизация сферопластов. 3.Вместо гомогенизации можно добавить детергент (если не важна нативность белков). 4.Для выделения плазмидной ДНК можно миновать стадию сферопластов и просто обработать клетки щелочью в присутствии детергента. 5.Крайний вариант – ультразвук. Но в этом случае возможно дробление белка или ДНК(РНК). © Karabelsky A.V

В основе методов экстрагирования лежит размельчение материала в соответствующем буфере с последующим центрифугированием смеси. © Karabelsky A.V

2-3. Обработка объекта и выделение нужной фракции ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЕДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЕ © Karabelsky A.V

Константы седиментации различных частиц © Karabelsky A.V

3. Варианты центрифугирования (для молекул, которые незначительно отличаются по размеру и величине S) © Karabelsky A.V

Методы детекции нужных фракций © Karabelsky A.V

3. Варианты экстракции (в зависимости от целей) 1. Если есть опасность действия протеаз – все процедуры проводят на холоду + добавляют стабилизаторы (сахароза, глицерин, ЭДТА) 2. Для выделения суммарной фракции белков мембран можно обработать их детергентами (SDS, тритон x-100). 3. Если цель-это очистка нуклеиновых кислот, то можно добавить к раствору протеазы. Таким образом, избавиться от белков. 4. Для отделения РНК от ДНК – можно добавить фермент, расщепляющий ту или иную кислоту. © Karabelsky A.V

4. Выделение суммарных фракций белков. Один из вариантов выделения суммарных фракций белков – добавление к раствору сульфата аммония до 80% насыщения (высаливание). Возможно добавление детергентов или мочевины, если не важна нативность белка. О процессе высаливания см. дальше. © Karabelsky A.V

4. Выделение суммарной фракции нуклеиновых кислот. Основной способ – это обработка смесью фенол-хлороформ. Белки разрушаются и легко отделяются центрифугированием. © Karabelsky A.V

Целью большинства биохимических исследований является изучение свойств различных белков. Поэтому в дальнейшем будут приведены описания основных методик работы с белковыми препаратами. Будут описаны методы детекции белка в растворе и методы его выделения и очистки. © Karabelsky A.V

5. Основные методы детекции белков !! 1.Электрофорез 2. Иммуноблоттинг 3. Определение концентрации белка в растворе (колориметрические и спектрофотометрические методы) © Karabelsky A.V

Электрофорез. В основе метода электрофореза лежит миграция макромолекул в электрическом поле. Движение белков обусловлено наличием на их поверхности заряженных радикалов АК ДНК и РНК – заряжены отрицательно всегда © Karabelsky A.V

Электрофорез молекул. Раствор с препаратом помещают в гель (подобный пищевому желе), причем этот гель подобен сетке – со строго определенным размером пор. Гель находится в буфере, через который может проходить ток. При подаче тока молекулы будут двигаться в определенном направлении (в зависимости от своего суммарного заряда) через поры этого геля. Причем более крупные частицы будут двигаться медленнее – так как постоянно будут натыкаться на сетку геля. Через определенное время мы получим разделение молекул по размеру и по заряду. © Karabelsky A.V

Варианты гелей. Агарозный гель. В основном используется для разделения нуклеиновых кислот. Агароза – чистая фракция природного полисахарида агара. Поставляется в порошках. Гелеобразование происходит после растворения агарозы в буфере, нагревания до кипения и остывании. При остывании нити агарозы за счет водородных связей образуют жгуты. Жгуты перекрещиваются и образуют пористую структуру. Размер пор зависит от исходной концентрации агарозы. (0.8% гель для ДНК-ЭФ) © Karabelsky A.V

Полиакриламидный гель (ПААГ, PAAG) Полиакриламид – продукт полимеризации акриламида. Полиакриламидные нити могут быть связаны между собой с помощью молекул N,N- метиленбисакриламида. После совместной полимеризации получаем структуры с порами. Размер пор зависит от исходных концентраций обоих компонентов. © Karabelsky A.V

Структура ПААГ © Karabelsky A.V

Приготовление геля. Смешивают растворы АА и БисАА в нужном буфере. Добавляют воду, инициатор полимеризации (персульфат аммония) и ускоритель полимеризации (ТEMED) © Karabelsky A.V

Разделение белков М (кДа) %АА (процент ПААГ) >300 5 © Karabelsky A.V

Варианты электрофореза Вертикальный (в основном в ПААГ, для разделения белков) Горизонтальный (агарозный гель, разделение нуклеиновых кислот) © Karabelsky A.V

Камера для ЭФ © Karabelsky A.V

ЭФ в ПААГ в присутствии ДСН ДСН (додецилсульфат натрия, SDS)– детергент. Связывается с белками за счет гидрофобных взамодействий и растягивает их. Сульфокислота ДСН делает все белки ОТРИЦАТЕЛЬНО заряженными. Таким образом возможно разделение белков только по их размеру. При этом скорость миграции белка при определенной напряженности электрического поля - величина, зависящая только от размера белка. Ее называют электрофоретической подвижностью. © Karabelsky A.V

Использование ЭФ-маркеров В строгих условиях опыта величина электрофоретической подвижности - это постоянная величина. Поэтому при проведении ЭФ можно сравнить ее с подвижностью известных белков (маркёров) с известной молекулярной массой. Таким образом можно определить размер исследуемого белка. © Karabelsky A.V

Проведение ЭФ в ПААГ с ДСН © Karabelsky A.V

Варианты белкового ЭФ. Нативный ЭФ (кислый или щелочной) Двумерный ЭФ Электрофорез в ИЭТ Изоэлектрофокусирование Изотахофорез Диск-ЭФ © Karabelsky A.V

Двумерный ЭФ 1й этап – разделение по размеру в одних условиях. Поворот геля на 90 градусов и проведение ЭФ в других условиях (например в градиенте рН или в буфере с другим рН) © Karabelsky A.V

ЭФ в ИЭТ рН буфера для ЭФ соответствует ИЭТ (изоэлектрическая точка) исследуемого белка. При подаче напряжения белки с отличной ИЭТ мигрируют к разным полюсам. Нужный белок остается в лунке геля. © Karabelsky A.V

Изоэлектрофокусирование В этом методе используется градиент рН в постоянной электрическом поле. При этом белки двигаются до тех пор, пока не станут электронейтральными. Есть методы ПРЕПАРАТИВНОГО ИЭФ. © Karabelsky A.V

Изотахофорез В этом методе белки разделяются в Градиенте напряжения. Каждая белковая зона будет обладать собственной подвижностью – в этой зоне будет свое значение напряжения. Граница между зонами четкая. Размер зоны зависит от исходного количетва белка. © Karabelsky A.V

Диск-ЭФ В одной системе используют два геля разной пористости. Верхний гель служит для концентрирования белковой пробы. Нижний гель – для разделения белков по размеру. © Karabelsky A.V

Диск-ЭФ Концентрирующий Гель (6%) Разделяющий гель % или др. © Karabelsky A.V

Разберем последовательно процесс проведения Диск-ЭФ Приготовление пробы. Пробу белка после осаждения, выделения или очистки осаждают 10% ТХУ. Осадок белков растворяют в буфере для проб, который содержит буфер трис-HCl-ЭДТА, глицерин, меркаптоэтанол, бромфеноловый синий и ДСН. © Karabelsky A.V

Приготовление геля 1.Сперва в камеру для геля заливают разделяющий гель (например 12% ПААГ). Его готовят на буфере с щелочным значением рН (около 9). 2.После застывания геля сверху наливают раствор концентрирующего геля (обычно 6%), в буфере с рН 6.8. Делают лунки для проб. © Karabelsky A.V

Установка геля. Гель устанавливают в камеру и наливают сверху трис-глициновый буфер. © Karabelsky A.V

Нанесение пробы Пробы перед нанесение кипятят 5-10 минут и наносят в лунки геля. В соседние лунки помещают пробу с маркерными белками с известной подвижностью. © Karabelsky A.V

Проведение ЭФ Сперва ЭФ проходит при 50В (около 10мА). После того, как белки войдут в разделяющий гель – ЭФ проводят при В. Белки мигрируют от – к +. Скорость миграции контролируют по степени миграции красителя (он всегда идет первым). © Karabelsky A.V

Проявка геля. После ЭФ гель вытаскивают. Обрабатывают ИПС для фиксации белков в порах геля и помещают в раствор с красителем (обычно кумасси синий) на 1-2 часа. После этого гель отмывают в уксусной кислоте. Белки на геле видны в виде полос синего цвета. © Karabelsky A.V

2. Метод блоттинга Существует несколько видов блоттинга. Все они сводятся к тому, что иследуемый образец переносят на нитроцеллюлозный фильтр и помещают этот фильтр в раствор, в котором содержится вещество, способное гибридизоваться с образцом. Места гибридизации видны после специальных методов проявки. © Karabelsky A.V

Варианты блоттинга Саузерн-блоттинг : перенос ДНК на фильтр (в дальнейшем возможна гибридизация с меченой ДНК за счет комплементарности радиоавтография) Нозерн-блоттинг: перенос РНК Вестерн-блоттинг: перенос белков. Обычно проявку белков осуществляют за счет гибридизации белка с антителами. Поэтому этот вид блоттинга называют иммуноблоттингом. © Karabelsky A.V

Вестерн-блот. Перенос © Karabelsky A.V

Вестерн-блот. Проявка © Karabelsky A.V

3. Определение концентрации белка в растворе Колориметрические методы Биуретовый метод – образование в щелочной среде комплекса пептидных связей с ионами меди. 540нм Метод Лоури – Образование комплекса ароматических АК с реактивом Фолина + биуретовая реакция. 750 нм Метод Брэдфорд – основан на связывании с белками красителя кумасси синего, спектр поглощения которого при этом меняется. 595 нм. Спектрофотометрический метод. Основан на способности ароматических АК поглощать УФ свет 280нм. Этот метод используется и для определения концентрации нуклеиновых кислот. © Karabelsky A.V

Методы выделения и очистки белков. 1.Фракционирование и концентрирование. -Осаждение -Ультрафильтрация 2. Разделение и очистка -гель-фильтрация -Хроматография © Karabelsky A.V

Фракционирование и концентрирование белков. Методы осаждения. 1.Высаливание. Добавление к раствору сульфата аммония до определенной степени насыщения. 2.Осаждение органическими растворителями (ацетоном) 3.Осаждение органическими полимерами (ПЭГ) © Karabelsky A.V

Методы осаждения Высаливание Осаждение органическими растворителями или ПЭГ © Karabelsky A.V

Ультрафильтрация Препарат с белком прогоняют через мембрану, которая имеет поры определенного диаметра. Белки, размер которых меньше диаметра пор, спокойно через них проходят. Крупные белки при этом концентрируются. © Karabelsky A.V

Гель-фильтрация (гель- проникающая хроматография) © Karabelsky A.V

Многообразие гелей для гель- фильтрации © Karabelsky A.V

Метод ХРОМАТОГРАФИИ -Ионообменная -Аффинная -Иммунноафинная -На окрашенных адсорбентах -Распределительная Все эти методы чаще всего применяются на колонках – колоночная хроматография. © Karabelsky A.V

Ионообменная хроматография © Karabelsky A.V

Сорбенты для ионообменников Анионообменники - ионообменная группа DEAE – диэтиламиноэтил. Катионообменники – Карбоксиметильная группа. © Karabelsky A.V

Ход ионообменной хроматографии 1.Посадка белка на колонку (в буфере, рН которого отличается от изоточки белка на в ту или другую сторону) 2.Промывка колонки исходным буфером (при этом несорбированные белки удаляются) 3.Элюция (десорбция) белка, за счет смены буфера. Новый буфер на 1-2 единицы рН отличается от исходного (его рН находится по другую сторону изоточки белка). Белок сходит с колонки. Элюцию можно осуществлять и в градиенте концентрации соли. © Karabelsky A.V

Аффинная хроматография Метод основан на специфичном взаимодействии белка с некоторыми веществами (рецептор- лиганд, фермент-субстрат, белок-антитело и т.д.) Лиганд изначально сорбирован на колонке. При нанесении пробы он связывается с белком. Элюцию белка можно проводить разными способами. Самый простой способ – резкое изменение рН или высокие концентрации соли. © Karabelsky A.V

Иллюстрация аффинной хроматографии © Karabelsky A.V

Иммунноаффинная хроматографии Этот метод является вариантом обычной аффинной хроматографией. В качестве лиганда используются специфические антитела. © Karabelsky A.V

Хроматография на окрашенных адсорбентах Хроматография на окрашенных адсорбентах получила широкое распространение, что обусловлено относительной дешевизной и высокой емкостью сорбента. Специфичность адсорбентов, связанных с красителем, такова, что их можно считать аффинными адсорбентами, хотя используемый краситель имеет мало сходства и истинным лигандом. Поэтому этот тип хроматографии часто называют псевдо-аффинной хроматографией. Чаще всего окрашенные адсорбенты используют для очистки нуклеотид-связывающих белков. При низкой ионной силе и относительно низких значениях рН окрашенные адсорбенты являются эффективными катионообменниками, так как благодаря наличию множества отрицательных зарядов они связывают основные белки. В некоторых случаях, адсорбент обладает высоким сродством к белкам, которые не имеют нуклеотид-связывающих центров, например, к альбумину и интерферону. © Karabelsky A.V

Краситель на поверхности сорбента F3GA © Karabelsky A.V

Распределительная хроматография В основе этого метода лежит разделение веществ по их растворимости в различных растворителях. Часто этот метод называют гидрофобной хроматографией. Распространенный вариант - модификация агарозы алифатическими углевородородами. Они создают на поверхности сорбента сильно-гидрофобную среду, за счет чего белки могут залипать своими гидрофобными группами. Элюцию проводят либо просто водой, либо снижением концентрации солей (например сульфата аммония). © Karabelsky A.V