Молекулярный контроль биосинтеза бета-лактамных антибиотиков» Молекулярный контроль биосинтеза бета-лактамных антибиотиков»

Некоторые этапы исследования и индустрии бета-лактамных антибиотиков 1929 Открытие пенициллина Разработка технологий ферментации P.chrysogenum 1945 Нобелевская премия по медицине - Флеминг, Флори, Чейн 1945, 1955 Открытие цефалоспорина 1964 Нобелевская премия по химии, Дороти Ходжкин ые Селекция промышленных штаммов – продуцентов Первые работы по генетической инженерии P.chrysogenum, A.chrysogenum 2001 Промышленное производство 7-АДЦК с помощью рекомбинантного штамма P.chrysogenum 2008 Расшифрован геном P.chrysogenum

Индустрия бета-лактамных антибиотиков сегодня Крупнейший сектор мировой биотехнологической промышленности Объем рынка ~US$ 10 млрд, ~ 50 % мирового рынка антибиотиков. Основное производство – Европа, Китай, Корея, Индия.. Рынок пенициллинов – 3,5 млрд долларов, мировое производство – тонн. Основные компании – производители: DSM (Нидерланды), Bristol- Myers-Squibb (США), Glaxo-Smith Kline (США), Biochimie/Hoechst (Германия), North-China Pharma Works (Китай) Рынок цефалоспоринов – 7 млрд долларов, мировое производство – цефалоспорин С – 4300 тонн, 7-АЦК ~ 2200 тонн, 7-АДЦК ~ 2000 тонн. Основные компании – производители: Antibioticos SpA (Италия, Испания), Fujisawa (Япония), Bristol-Myers-Squibb (США), Glaxo-Wellcome (Великобритания), Biochimie/Hoechst (Германия), Cheil Jedang (Корея)

Классификация бета-лактамных антибиотиков Группа Парентеральные Пероральные Пенициллины Чувствительные к b-лактамазам Ампициллин, Карбенициллин, тикарциллин, мезлоциллин, азлоциллин, пиперациллин, Бензилпенициллин Амоксициллин, ампициллин, Кариндациллин, Феноксиметилпенициллин Устойчивые к b-лактамазам Метициллин, оксациллин, нафциллинКлоксациллин, диклоксациллин Комбинированные препараты, включающие ингибитор b-лактамаз Тикарциллин/клавуланат, ампициллин/сульбактам, пиперациллин/тазобактам Амоксициллин/клавуланат Цефалоспорины Первого поколения Цефазолин, цефалотин, цефапиринЦефалексин, цефрадин, цефадроксил Второго поколения Цефамандол, цефуроксим, цефоницид, цефоранид, Цефокситин, цефотетан, цефметазол Цефаклор, цефуроксим аксетил, цефиксим а, цефпрозил, цефподоксим а, лоракарбеф Третьего поколения Цефтриаксон, цефотаксим, цефтизоксим, Цефтазидим, цефоперазон Нет Четвертого поколения Цефепим, ЦефквиномНет Карбапенемы Имипенем/циластатинНет Монобактамы Азтреонам Нет

Этапы селекции промышленных штаммов P.chrysogenum и A.chrysogenum mg/ml (SIPI, CN) ATCC11550 CK-101 М-8650 СВ-344 CW-19, C-10 ЦБИ-104 А3,2, А7, B, C (Antibioticos) KFCC10785 CJCorp, KR g/ml 2-5 mg/ml P.chrysogenum А.chrysogenum

« До-геномные» представления о генетических и биохимических изменениях у промышленных штаммов P.chrysogenum У супепродуцентов тандемно амплифицирован кластер генов биосинтеза пенициллина - pcbAB, pcbC and penDE, хотя нет линейной зависимости между числом копий и уровнем продукции. У суперпродуцентов более развиты микротельца - компартменты биосинтеза penG У суперпродуцентов инактивирован путь катаболизма фенилуксусной кислоты - экзогенного предшественника, боковой цепи бензилпепнициллина – точковая мутация в гене микросомального цитохрома P450 (pahA )

Геном Penicillium chrysogenum

Транскриптомика P. chrysogenum Поиск с помощью микрочипов дифференциально-транскрибируемых генов у двух штаммов: Wis – умеренный, лабораторный продуцент, расшифрован геном DS промышленный продуцент, в условиях продукции penG. Функциональные категории генов Число генов с экспрессией DS17690> Wis Число генов с экспрессией DS17690 < Wis Рост и метаболизм От предшественников к penG Секреция penG Пероксисомальные Метаболизм бета-лактамов Метаболизм фенилуксусной кислоты Клеточная дифференцировка и морфология Другие Всего

Протеомика P. chrysogenum Jami MSJami MS, Barreiro C, García-Estrada C, Martín JF. Proteome analysis of the penicillin producer Penicillium chrysogenum: Characterization of protein changes during the industrial strain improvement. Mol Cell Proteomics. 2010Barreiro CGarcía-Estrada C Martín JF Сравнение цитозольных протеомов трех штаммов Penicillium chrysogenum NRRL 1951 – дикий тип, Wis – умеренный, лабораторный продуцент, расшифрован геном, AS-P-78 - промышленный продуцент Идентифицированы 950 белков, дифференциально представленных у трех штаммов в условиях вегетативного роста

Прогрессивно снижены по сравнению со штаммом дикого типа: Факторы вирулентности, белки деградации клеточных стенок, ферменты деградации пенициллина, Ферменты биосинтеза других вторичных метаболитов – терпеноидов, порфиринов, пигментов Прогрессивно усилены у умеренного продуцента и промышленного штамма: Биосинтез цистеина – аминокислота-предшественник пенициллина, Биосинтез NADPH – необходим для синтеза пенициллина, 10 молей NADPH на 1 моль пенициллина Уровень ферментов энергетического обмена – цикл трикарбоновых кислот, пентозофосфатный путь. Ответ на окислительный стресс – адаптация к условиям ферментации. Изменения метаболизма P.chrysogenum по данным сравнительного протеомного анализа Без изменения: Путь деградации фенилуксусной кислоты, альтернативные пути биосинтеза бета-лактамов – мишени для дальнейшего манипулирования.

Итоги сравнительного транскриптомного и протеомного анализа P.chrysogenum Penicillium chrysogenum – отличная модель для понимания глобальных изменений метаболизма, генной экспрессии, сигнальных путей, приводящих к усилению продукции целевого вторичного метаболита у грибов Помимо цитозольных белков важно идентифицировать и исследовать также мембранные транспортеры, обеспечивающие импорт предшественников и экспорт целевых продуктов. Усиление продукции пенициллина в ходе селекционных программ по улучшению промышленных штаммов – следствие интенсивной реорганизации метаболизма, основными факторами при этом являются энергетическая нагрузка, редокс метаболизм и доступность предшественников

«Обратная генетика» P.chrysogenum A.chrysogenum – нокдауны и нокауты У A.chrysogenum и P.chrysogenum есть функционально-активная система РНК- интерференции – экспериментально показано на модели сайленсинга гетерологичного DsRed Геном P.chrysogenum - есть ортологи Dicer и Argonaute На P. chrysogenum проведен нокдаун белка ku70 (фактор негомологичной рекомбинации) – на порядок возросла эффективность гомологичной рекомбинации В полученном штамме P2: KU70i проведен нокаут гена Pcdcl2 – гомолог Dicer – нет сайленсинга при нормальной внешней морфологии штамма. Индуцируемый нокдаун гетерологичного гена DsRed на P.chrysogenum

Цефалоспорин С – основной предшественник для получения полусинтетических бета- лактамных антибиотиков Мировое производство (2008 год) –Мировое производство (2008 год) – 6000 тонн цефС и его производных6000 тонн цефС и его производных >50 наименований полусинтетических цефалоспоринов I-IV поколений>50 наименований полусинтетических цефалоспоринов I-IV поколений Мировой рынок – 7 млрд $Мировой рынок – 7 млрд $

Acremonium chrysogenum – продуцент цефалоспорина С ATCC11550 – «дикий тип», Бротцу, Сардиния, 1942 год ATCC11550 – «дикий тип», Бротцу, Сардиния, 1942 год 26/8 – суперпродуцент цефС, Бартошевич, 1994 г.

Стратегии метаболической инженерии для A.chrysogenum Основаны на знании основного пути биосинтеза цефС Оптимизация «узких мест» биосинтеза Синтез предшественников, кофакторов Блокирование побочных реакций и путей деградации Улучшение физиологии и энергетического обмена Транспорт предшественников и конечных продуктов Инженерия ферментов – есть пространственные структуры всех ферментов биосинтеза цефС Инженерия новых метаболических путей и новых продуктов Промышленные штаммы Acremonium chrysogenum уступают в 2-3 раза по продуктивности промышленным штаммам Penicillium chrysogenum, Нет амплификации кластера генов биостнтеза цефС, следовательно, вместо долгой селекции…..

ГенШтаммЭффектыГодФирма cefEFATCC11550 («дикий тип») +15% CPC1989Elli Lilly cefGC10 (умеренный продуцент) +120%-210%CPC1997University of Leon cefD1+cefD2C10+80% CPC2004University of Leon cefTC10+120% CPC2002University of Leon cefTDS49834 (пром)+70% ad7-accca2008DSM, University Groningen cefG+pcbAB +pcbC+cefEF B,C (промышленные)+X% CPC??? -8% DAC,DAOC 2004Antibioticos cefG (пром)+70% CPC2010Shanghai IPI cefG+vgb (пром)+90% CPC2010Shanghai IPI pacC Wis54+300% PenG2004DSM pacC DS49834/cefT? (пром) +X% ad7-accca????, рост на сахарозе 2008DSM …. можно попробовать повысить продукцию цефС за счет оверэкспрессии одного или нескольких генов…

Экологически-чистые способы получения 7- аминодезацетоксицефалоспорановой к-ты с помощью рекомбинантных штаммов A.сhrysogenum и P.chrysogenum 7-АДЦК7-АЦК ~2000 т в год~2200 т в год Предшественник для получения полусинтетических цефалоспоринов орального применения Предшественник для получения большинства полусинтетических цефалоспоринов 150 $/кг120 $/кг малоэффективно

Биосинтез пенициллинов и цефалоспоринов ACV синтетаза (acvA/pcbAB) IPN синтаза (ipnA/pcbC) Пенициллин G, V, DF, F, K IPN ацилтрансфераза (aatA/penDE) DAOC синтетаза (cefEF) DAC ацетилтрансфераза (cefG) (cefG) IPN эпимераза (cefD1, cefD2, )

Транскрипционный контроль биосинтеза бета-лактамов у грибов

Модель активации РасС M. A. Penalva, 2002 ядро цитоплазма сигнал об изменении рН среды трансляция («закрытая» конформация) («открытая» конформация) (процессированная форма) сигнальный протелоиз авто- протеолиз ген расС ген расС у автопротеолиз автоактивация транскрипция каскад усиления Раl белков транспорт через ядерную пору

Строение белков семейства РасС сайт процессингасайт сигнальный протеазы NH 2 COOH ДНК-связывающий домен Cys 2 His 2 цинковый палец (сайт узнавания GCCARG) активирующий домен конформационный домен 1 конформационный домен 2 конформационный домен 3

/8 Цвет колоний (полная пластинчатая среда)коричневый, желтый кремовый Рост при 28 0 С (полная пластинчатая среда), дни Размер колоний (полная пластинчатая среда), см Наличие воздушного мицелия (полная пл. среда)+- Образование конидий на синтетической среденормальноередуцированное Основная морфологическая форма при глубинном культивировании на среде для ферментации, 72ч мицелий, конидии артроспоры Продукция цефалоспорина С, мкг/мл , ферментация 72h 26/8, ферментация 72h мицелиймицелий кодиниоспорыкодиниоспоры артроспорыартроспоры прорастающий мицелий 10 мкм

Сканирующая электронная микроскопия клеток штамма A.chrysogenum АТСС11550

Сканирующая электронная микроскопия клеток штамма A.chrysogenum 26.8

Подбор условий для эффективного протопластирования штаммов A. chrysogenum штаммфермент время протопластирования перед ДТТ0 часов1 часов2 часа3 часа Zym 1 мг/ мл Lyt 3 мг/ мл Zym 2.75 мг/ мл Lyt 3 мг/ мл Zym 0.55 мг/ мл Lyt 10 мг/ мл Zym 2.75 мг/ мл Lyt 10 мг/ мл /8 Zym 2.75 мг/ мл Lyt 3 мг/ мл Zym 0.55 мг/ мл Lyt 10 мг/ мл Zym 2.75 мг/ мл Lyt 10 мг/ мл типичный мицелий (для данного штамма A. chrysogenum) +++ начальная деградация мицелия, частичная сегментация и утончение гиф ++ сильная деградация мицелия, утонченные гифы + очень сильная деградация мицелия (на %), практически нет оформленных гиф + очень сильная деградация мицелия (на %), практически нет оформленных гиф - полная деградация мицелия - полная деградация мицелия использовано в дальнейшей работе

Агробактериальная трансформация Растения Растения Клетки млекопитающих Клетки млекопитающих Грибы ( Грибы (Saccharomyces cerevisiae, Magnaporthe grisea, Fusarium oxysporum, Aspergillus awamori, Acremonium chrysogenum …) Calonectria morganii, Acremonium chrysogenum …) 10 мкм A.tumefaciens AGL0 c кассетой для переноса pZEM5 Прорастающий мицелий A.chrysogenum 26/8

Экспрессионные вектора для A.chrysogenum

A.chrysogenum Схема эксперимента по агробактериальной трансформации A.chrysogenum Отбор трансформантов, скрининг Инактивация Agrobacterium tumefaciens Культивирование на агаризованной среде с фильтрами Глубинное ко-культивирование Создание векторной системы для переноса в Agrobacterium tumefaciens Трансформация полученных конструкций в Agrobacterium tumefaciens A.chrysogenum Выбор морфологической формы A.chrysogenum для АТМТ Получение конидий для A.сhrysogenum АТСС11550 Подготовка препаратов мицелия A.chrysogenum Для A.chrysogenum 26/8 Инкубация A.chrysogenum с Agrobacterium tumefaciens

G418Zeocin TM Штамм A.chrysogenum / Метод 1 Перенос колоний на фильтрах 2-5 * * * Метод 2 Глубинное культивирование 1-3 * * * Частоты агробактериальной трансформации A.chrysogenum

Анализ трансформантов

Стратегии создания рекомбинантных штаммов A.chrysogenum c улучшенными характеристиками Введение дополнительных копий биосинтетических генов Усиление транспорта цефС из клетки Оптимизация транскрипции генов биосинтеза Усиление импорта предшественников биосинтеза цефС

Транспорт цефС в A.chrysogenum cefT «ранние» гены «поздние» гены cefT Модель пространственной организации cefM и сefT

Вектора экспрессии cefT

S S Маннопротеины 40% GPI якоря 1-3 глюкан 50% 1-6 глюкан 8% Хитин 2% Трансмембранные белки МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ

Белки КС A.chrysogenum Структурные изменения КС у штамма A.chrysogenum - суперпродуцента цефС связаны с резким снижением количества ферментов, участвующих в поддержании ее структуры, отсутствием фракции белков, ковалентно- связанных с полисахаридным матриксом КС. ATCC11550 #26/8 24 ч 48 ч 120 ч 24 ч 48 ч 120 ч SEP- белки 24 ч 48 ч 120 ч 24 ч 48 ч 120 ч GPI-белки

Электронная микроскопия клеточных стенок штамма АТСС11150 A. chrysogenum (А, Б, В) и клеточных стенок штамма 26/8 A. chrysogenum (Г, Д, Е, Ж, З). – на разных стадиях роста. Морфология и структура КС штаммов A.chrysogenum Различия в морфологии и структуре клеточных стенок штаммов ATCC11550 и 26/8. затрагивают молекулярную организацию КС и в значительной степени зависят от условий культивирования штаммов Чувствительность препаратов КС к действию гидролаз и детергентов.

Неорганические полифосфаты - источник энергии при синтезе цефС Падение уровня АТФ в штамме 26\8 в условиях индукции синтеза цефС Снижение содержания высокомолекулярных фракций полиР2, полиР3 и полиР5 и возрастание содержания низкомолекулярной полиР1 при синтезе цефС у A.chrysogenum.

Дифференциальная экспрессия Н+АТРазы плазмалеммы у разных штаммов A.chrysogenum Динамика изменения активности Н+-АТФазы в штаммах 26/8 (1,2) и АТСС (3,4) при выращивании на крахмале (1,3) и на глюкозе (2,4) Различия в уровнях активности Н+- АТФазы в штамме 26/8 и АТСС 11550

Штамм A.chrysogenum ЦБИ-104 – суперпродуцент цефС