{ Применение скрининговых методов при государственном мониторинге пищевой продукции и кормов Ирина Нестеренко в.н.с. отдела безопасности пищевой продукции ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации средств для животных и кормов» ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»

Классификация методов, применяемых при мониторинге пищевой продукции и кормов Классификация методов, применяемых при мониторинге пищевой продукции и кормов Виды скрининговых методов Виды скрининговых методов Скрининговые методы, разрабатываемые и применяемые в ФГБУ «ВГНКИ» Скрининговые методы, разрабатываемые и применяемые в ФГБУ «ВГНКИ» План

Приоритетные ксенобиотики Хлорамфеникол Тетрациклины Бацитрацин Аминогликозиды β-лактамы Хинолоны Сульфаниламиды Нитрофураны Кокцидиостатики Макролиды β-адреностимуляторы Нитромидазолы Карбадокс, олаквиндокс Полимексины Цефалоспорины

Классификация методов СКРИНИНГ ПОДТВЕРЖДЕНИЕ Стратегия контроля остаточного содержания лекарственных средств в кормах и животноводческой продукции включает использование скрининговых и подтверждающих методов.

Скрининговые методы Скрининговый метод: используется для определения присутствия соединения или класса соединений на определенном уровне. Согласно Решению Комиссии 2002/657/ЕС Основная задача: анализ большого количества образцов для отбора потенциально несоответствующих из большого количества проб

Биологические методы обнаруживают клеточные ответы на анализы (например, эстрогенный эффект, торможение роста бактерий, клеточный эффект, гормональный эффект.) Биохимические методы обнаруживают молекулярные взаимодействия (например, антигены, белки) между анолитами и антителами или рецепторными белками (ИФА, радиоиммуноанализ) Физико-химические методы различают химическую структуру и молекулярные характеристики анализов путем разделения молекул Классификация скрининговых методов По принципу обнаружения:

Качественные методы дают ответ да/нет без указания концентрации анализируемого вещества Качественные методы дают ответ да/нет без указания концентрации анализируемого вещества Полуколичественные методы дают примерное указание на концентрацию предполагаемого анолита Полуколичественные методы дают примерное указание на концентрацию предполагаемого анолита Количественные методы соответствуют тем же требованиям к точности, динамическому диапазону и прецизионности, что и подтверждающие методы Количественные методы соответствуют тем же требованиям к точности, динамическому диапазону и прецизионности, что и подтверждающие методы Классификация скрининговых методов По степени количественного определения :

Примеры скрининговых методов Микробиологические методы Иммунохимические методы Хроматографические методы

Иммунохимические методы + Y Y Инструментальные иммуноферментный анализ, поляризационный флуоресцентный иммуноанализ, капиллярный иммуноэлектрофорез Неинструментальные различные виды иммунохроматографических тест-методов: тест-полоски, тандемные колонки, иммунофильтрационный

Иммунохроматографические методы образецYYY конъюгатантитело-золото конъюгатаналит-белок антивидовые антитела адсорбционная мембрана YYY положительный образец YYY отрицательный образец

Тест-полоски (стрептомицин, пенициллин, хлорамфеникол и др.) Тест-полоски (стрептомицин, пенициллин, хлорамфеникол и др.) Иммунофильтрационные тесты Иммунофильтрационные тесты Иммунохроматографические методы

Иммуноферментный анализ Конкурентный ИФА Непрямой YY Y Y Y YY E S P YY E Y Y Y Y E Y Y E Прямой E E S P Y Y Y E Y Y Y E

Хлорамфеникол-ИФА Хлорамфеникол-ИФА Тетрациклины-М-ИФА Тетрациклины-М-ИФА Фторхинолоны-ИФА Фторхинолоны-ИФА Энрофлоксацин-ИФА Энрофлоксацин-ИФА Фуразолидон-ИФА Фуразолидон-ИФА Тренболон-ИФА Тренболон-ИФА Иммуноферментный анализ Тест-системы, разрабатываемые в ФГБУ «ВГНКИ» Производитель: ЗАО «НВО «Иммунотех», г. Москва В процессе разработки: Трифенилметановые красители -ИФА Карбадокс-ИФА Никарбазин-ИФА

Хлорамфеникол-ИФА Предел количественного определения: 0,3 мкг л -1 для молока и сливок; 0,3 мкг кг -1 для мяса и яиц Условия инкубации (время, температура) : - инкубация 1 час при +37 °С; - инкубация с ТМБ 15 мин при +(18-25)°С. Время проведения анализа: 1,5 часа (без учета времени пробоподготовки). Количество анализируемого образца: 50 мкл. Количество анализов: тест-система рассчитана на проведение анализа в дубликатах 42 исследуемых образцов и 6 калибровочных растворов, всего 96 определений. Срок годности набора: 6 месяцев. МУК Регистрационное свидетельство ПВР-1-7.8/02280

Тетрациклин-М-ИФА Предел количественного определения: 1 мкг/л для молока; 10 мкг кг -1 для сухого молока Условия инкубации (время, температура) : -инкубация 1,5 часа при +37 °С; -инкубация 1 часа при +37 °С - инкубация с ТМБ 15 мин при +(18-25)°С. Время проведения анализа: 4 часа (с учетом времени пробоподготовки). Количество анализируемого образца: 50 мкл. Количество анализов: тест-система рассчитана на проведение анализа в дубликатах 42 исследуемых образцов и 6 калибровочных растворов, всего 96 определений. Срок годности набора: 6 месяцев. Регистрационное свидетельство ПВР-1-8.9/02460

Тренболон-ИФА Свидетельство о государственной регистрации ПВР-1-1.5/01469 ГОСТ Р –2009 ПРОДУКЦИЯ ЖИВОТНОВОДСТВА И КОРМА. Иммуноферментный метод определения синтетических анаболических стимуляторов роста Предел количественного определения: в моче - 1,0 мкг л -1 ; в мышечной ткани - 1,0 мкг кг -1 ; в печени - 1,0 мкг кг -1. Условия инкубации (время, t о С) : - инкубация 1 час при +37 о С; - инкубация с ТМБ 15 мин при +37 о С. Время проведения анализа: 3,0 часа (без учета времени пробоподготовки). Количество анализируемого образца: 10 мкл. Количество анализов: тест-система рассчитана на проведение анализа в дубликатах 42 исследуемых образцов и 6 калибровочных растворов, всего 96 определений. Срок годности набора: 6 месяцев.

Энрофлоксацин-ИФА ФторхинолонCR*, % энрофлоксацин 100 ципрофлоксацин 2 % др. фторхинолоны*< 0,1 % CR – процент перекрестного реагирования **Др. фторхинолоны – норфлоксацин, флюмеквин, сарафлоксацин, марбофлоксацин, дифлоксацин, дан офлоксацин, ломефлоксацитн Предел количественного определения: в молоке - 1,0 мкг л -1 ; в рыбе- 1,0 мкг кг -1 ; в мясе - 1,0 мкг кг -1. Условия инкубации (время, t о С) : - инкубация 1 час при +37 о С; - инкубация с ТМБ 10 мин при +37 о С. Время проведения анализа: 2,5 часа (без учета времени пробоподготовки). Количество анализируемого образца: 50 мкл. Количество анализов: тест-система рассчитана на проведение анализа в дубликатах 42 исследуемых образцов и 6 калибровочных растворов, всего 96 определений. Срок годности набора: 6 месяцев.

Фторхинолоны-ИФА Предел количественного определения Молоко, мясо, яйца, рыба – 5 мкг кг -1 Специфичность ФторхинолонCR*, % энрофлоксацин 100 ципрофлоксацин 100 дан офлоксацин 38 норфлоксацин 8 офлоксацин 5 ломефлоксацин 20 сарафлоксацин 12 Др. фторхинолоны**< 1 * CR – процент перекрестного реагирования **Др. фторхинолоны – флюмеквин,, марбофлоксацин, дифлоксацин

Фуразолидон-ИФА Предел количественного определения: 1 мкг л -1 для молока и сливок; 1 мкг кг -1 для мяса и яиц Условия инкубации (время, температура) : - инкубация 1 час при +25 °С; - инкубация с ТМБ 10 мин при +(18-25)°С. Время проведения анализа: 1,5 часа (без учета времени пробоподготовки). Количество анализируемого образца: 50 мкл. Количество анализов: тест-система рассчитана на проведение анализа в дубликатах 42 исследуемых образцов и 6 калибровочных растворов, всего 96 определений. Срок годности набора: 6 месяцев.

Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ Новая тенденция при создании скрининговых методов – разработка экспрессных методик, время анализа в которых занимает менее 10 минут. К таким методам относится поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА), выгодно отличающийся быстротой проведения реакции и возможностью ее автоматизации Принцип метода: конкуренция между антигеном и меченным флуоресцентной меткой антигеном за центры связывания антител F F F F F Y Y Y Y Y Y Y Y Y F F F Y измерение Y Y Y Y F F F Y F Y - антиген - антиген, меченный флуоресцентной меткой (трейсер) - антитела

Принцип поляризации флуоресценции Деполяризованный свет Поляризатор Поляризованный свет трейсер (быстрое вращение) Излучаемый свет деполяризован Высокая поляризация флуоресценции Низкая поляризация флуоресценции Излучаемый свет поляризован

Оборудование 1 образец – 10 с 10 образцов – 7 мин 40 образцов – 5 мин Один образец Карусель из 10 образцов Планшетный формат

Тест-системы для определения микотоксинов в кормах Тест-система Диапазон концентраций, мкг кг -1 Специфичность, % Зеараленон-ПФИА3-40 Зеараленон – 100 α-зеараленол – 40 зеранол -– 25 ДОН-ПФИА ДОН – ацетил-ДОН – 90 Ниваленол –

Скрининговые методы используются для определения присутствия соединения или класса соединений на определенном уровне. Арбитражные (или подтверждающие) применяют для подтверждения результатов скрининга В ФГБУ «ВГНКИ» создана система скрининговых (иммунохимических и хроматографических) и подтверждающих (хроматомассспектрометрических) методов определения остаточного содержания ряда ветеринарных лекарственных средств, в частности для определения антибиотиков тетрациклиновой группы, фторхинолонов, хлорамфеникола и др. Разработано 6 тест-систем ИФА для определения хлорамфеникола, тетрациклинов, фторхинолонов, нитрофуранов и тренболона, а также 4 тест-системы для экспрессного определения: зеараленона, ДОНа, охратоксина А и афлатоксина В 1 методом ПФИА. Нормативная документация на тест-системы рассмотрена и утверждена на ТК 454 «Охрана жизни и здоровья животных и ветеринарно-санитарная безопасность продуктов животного происхождения и кормов» Резюме

Спасибо за внимание! ФГБУ «ВГНКИ» ФГБУ «ВГНКИ» Отдел безопасности кормов и пищевых продуктов Звенигородское шоссе, 5 Москва Россия +7(499) ЗАО «НВО Иммунотех» , г. Москва, ГСП-1, МГУ имени М.В. Ломоносова, Ленинские горы, д.1, строение 11А +7 (495)

Фуразолидон-ПФИА Фуразолидон-ПФИА Хлорамфеникол-ПФИА Хлорамфеникол-ПФИА Тетрациклин-ПФИА Тетрациклин-ПФИА Никарбазин-ПФИА Никарбазин-ПФИА Тест-системы в процессе разработки Целевая матрица- корма