Определение бета-блокаторов в допинговом контроле методом ВЭЖХ/МСВР с электрораспылительной и химической ионизацией при атмосферном давлении Вирюс Э. Д., Семенистая Е. Н., Родченков Г. М.
План доклада 1. Проблемы и задачи антидопингового контроля 2. ВЭЖХ/МС высокого разрешения (Orbitrap): использование в рутинных анализах. Выбор способа ионизации и хроматографической системы для рутинных анализов 3. Определения бета-блокаторов в моче.
Современные проблемы допингового контроля: Необходимость осуществлять анализ большого числа биологических проб сложного состава за короткое время (за 14 дней Олимпийских игр анализируются до 2500 проб) Необходимость определять большое число соединений при низких концентрациях. Некоторые определяемые соединения имеют эндогенное происхождение (половые гормоны, глюкокортикостероиды) или близки по структуре к эндогенным соединениям (анаболические стероиды) Рост числа запрещенных препаратов Высокая чувствительность ( нг/мл) Высокая селективность Универсальность (определение разных классов веществ за один анализ) Возможность проведения ретроспективного анализа Требования к аналитическим методам:
Запрещенные классы/методы Предел обнаружения методами ВЭЖХ/ГХ - масс-спектрометрии, нг/мл Вещества, запрещенные в соревновательный и внесоревновательный периоды Анаболические агенты 2-10 Гормоны и относящиеся к ним соединения Бета-агонисты100 Анти-эстрогены50 Диуретики и другие маскирующие агенты 250 Химические и физические манипуляции Усилители кислородного переноса (кровяной допинг) Генный допинг Вещества, запрещенные в соревновательный период (дополнительно к перечисленным выше) Стимуляторы Наркотики Каннабиноиды15 Глюкокортикостероиды30 Вещества, запрещенные в отдельных видах спорта (дополнительно к перечисленным выше) Алкоголь Бета-блокаторы500 Список запрещенных ВАДА препаратов/методов(2009)
Выбор источника ионизации и хроматографической системы Способ ионизацииESI Скорость потока распыляющего газа (N 2 ), отн.ед. 30 Скорость потока вспомогательного газа (N 2 ), отн.ед. 5 Подвижная фаза А: 5 мМ ацетата аммония в 0.01% растворе муравьиной кислоты (рН 3) В: метанол Условия градиентного элюирования 0 мин – 30 % B; 10 мин – 95 % B; 15 мин – 95 % B; 17 мин – 30 % B; 22 мин – 30 % B Скорость потока, мкл/мин250 Хроматографическая колонка Restek Ultra C18, 100x2.1 мм I.D., 3 к Предколонка Restek Ultra C18, 10x2.1 мм I.D., 5 к Объем вводимой пробы, μл5 Рабочее давление на колонке, бар170
Схема пробоподготовки Глюкуронидаза, 30 мкл (140 Ед./мг) Фосфатный буфер, рН 6.4, 1 мл Моча, 3 мл Гидролиз 1 час при 57 о С Экстракция (10 мин на встряхивателе) и центрифугирование Упаривание орг. фазы и перерастворение в элюенте Анализ методом ВЭЖХ/МСВР Моча после гидролиза ЭФИР, 5 мл Карбонатный буффер, рН мкл МеОН/ Н 2 О ITSD
НазваниеAPCIESI t R, мин S/N t R, мин S/N Анаболические стероиды 1 3-гидроксистанозолол гидроксистанозолол оксандролон эпиоксандролон флюоксиместерон тренболон эпитренболон гидрокси- оралтуринабол эпиметендиол оралтуринабол гестринон тетрагидрогестринон НазваниеAPCIESI t R, минS/Nt R, минS/N Бета-агонисты 1фенотерол тербуталин бамбутерол кленбутерол сальбутамол формотерол сальметерол НазваниеAPCIESI t R, минS/Nt R, минS/N Анти-эстрогены 1фулвестран дигидроэкземестан экземестан аминоглутетимид анастразол транс-4-гидрокси-3- метокси-тамоксифен гидроксициклофенил НазваниеAPCIESI t R, минS/Nt R, минS/N Бета-блокаторы 1 Ацебуталол Алпренолол Бетаксолол Бисопролол Бунолол Буфетолол Карведиол Целипролол Лабеталол Левобунолол Метипранолол Метопролол Окспренолон Пропранолол Соталол Талинолол Тимолол Эсмолол
Использование химической ионизации для создания более универсальной скринниговой процедуры. Экспрессный анализ благодаря высоким скоростям потока. Возможность промывки различными растворителями продлевает срок службы предколонок и колонок.
Где можно более детально ознакомиться нашей работой E.D. Virus, T.G. Sobolevsky, G.M. Rodchenkov. Introduction of HPLC/orbitrap mass spectrometry as screening method for doping control // Journal of mass spectrometry (7). Р Э.Д. Вирюс, Г.М. Родченков. Применение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии высокого разрешения с фотоионизацией при атмосферном давлении для детектирования ультрамалых количеств анаболических стероидов // Масс-спектрометрия, 2007, Т. 4, С. 275 – 283 Э.Д.Вирюс, Т.Г.Соболевский, Г.М.Родченков – Обнаружение оксандролона и его метаболита в моче методом высокоэффективной хроматографии/масс-спектрометрии высокого разрешения с орбитальной ловушкой с химической ионизацией при атмосферном давлении после прекращения его приема // Журнал аналитической химии, 2009, 64 (1), С Е. Н. Семенистая, М. А. Дикунец, Э. Д. Вирюс, Г. М. Родченков. Определение экземестана и 17-гидроксиэкземестана методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией и масс-спектрометрией высокого разрешения // Журнал аналитической химии, 2010, 65 (5), С. 513–521