«Липидно- аналитические» работы, ( в т. ч. биомед. исследования ) Исследования механизмов участия конкретных липидов в физиологических процессах (сигналинг, мембраны и др. ) Свободно- радикальное окисление липидов Применение липидов (ФЛ) в нано- технологиях

ЧТО ТАКОЕ ЛИПИДОМИКА ? системно-уровневый анализ липидов и факторов, которые взаимодействуют с липидами» - Wenk M., 2005 (Nat Rev Drug Discov, 2005, 4, 594). системно-уровневый анализ липидов и их партнеров по взаимодействию» - Adibhatla R. et al.., 2006 (AAPS J, 8, E314) системная расшифровка связанной с липидами информации по идентификации липидов и их медиаторов - Serhan C. et al., 2006 (AAPS J, 8(2), E284) системное изучение всех липидов, молекул, с которыми они взаимодействуют и их функций в клетке» - Watson A.D., 2006 (J. Lipid Res., 47, 2101)

Годы Основные проблемы Методы Перспективны е разработки 1. ~ до 60 г.г биохимия жиров, их биологическое (в т.ч. мед.) значение колориметрические методы появление колоночной хроматографии липидов е г.г структурная роль липидов (фосфорлипидов) в биомембранах тонкослойная, газожидкостная и препаративная колоночная хроматография первые работы по сигнальным эффектам липидов (фосфор- инозитидов). Начало ВЭЖХ липидов е г.г. выявление множественной регуляторной роли липидов в клетке через процессы сигналинга масс- спектрометрия, ВЭЖХ Начало развития «липидомики» ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ БИОХИМИИ ЛИПИДОВ:

The structure of lipids

СОВРЕМЕННАЯ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ЖИДКО-МОЗАИЧНОЙ МОДЕЛИ М ЕМБРАНЫ (по: Cell Structure and function:Lipid Membrane.

СХЕМА ОБЩЕГО СТРУКТУРНОГО ЭЛЕМЕНТА АТФ-СВЯЗЫВАЮЩИХ КАССЕТНЫХ БЕЛКОВ-ТРАНСПОРТЕРОВ (АВС-БЕЛКОВ) КЛЕТОЧНОЙ МЕМБРАНЫ (J.Oram, R.Lawn, 2001)

- метаболический предшественник фосфатидилэтаноламина (ФЭ) и свингомиелина (СФ), источник липидных мессенджеров и биоактивных соединений: лиза-ФЛ, диглицеридов, арахидоновой кислоты; - участие в построении липопротеиновых частиц: а) в гепатоцитах, б) в эпителиальных клетках кишечника; - в печени: участие в образовании желчи, в реакциях цитохрома Р450; - в клетках мозга : источник холина; - в легких: обеспечение функции сурфактанта (ди-С16:0).

Фосфатидилсерин Фосфатидная кислота Фосфатидилинозит Фосфатидилсерин Фосфатидная кислота Фосфатидилинозит - влияние на внутримембранные белки - влияние на вне мембранные белки, прилегающие к мембране с обеих сторон областей водной фазы (цитозольная фосфорлипаза А 2, протеинкиназа С и др).

СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ АНИОННЫХ ФОСФОЛИПИДОВ ФОСФОЛИПИДФУНКЦИИ, СВОЙСТВА Фосфатидилсерин (ФС) Взаимодействие с внутриклеточной протеинкиназой С (8:1) Экстернализация в плазматической мембране при возбужденном состоянии клетки Знак для удаления клетки макрофагами (eat me) Взаимодействие с аннексином V, ингибирование PLA 2, воспалительный ответ Фосфатидная кислота (ФК) Стимуляция гидролиза ФХ фосфорлипазой sPLA 2 Предшественник лиза-ФК – активного сигнального мессенджера

ФОСФОЛИПИД ФУНКЦИИ, СВОЙСТВА Фосфатидилинозит (ФИ), фосфаты ФИ Трансдукция сигналов Участие в поддержании структуры кликолиз-ФИ-заякоренных белков и белков цитоскелета Присоединение к мембране белков через РН-домены (pleckstrin homology) Фосфатидилглицерин (ФГ) Участие в связывании белков легочного сурфактанта Активация ядерной протеинкиназы С Кардиолипин (КЛ) Участие в функционировании митохондрий за счет взаимодействия с рядом митохондриальных белков Участие в апоптозе путем свободно- радикального окисления и стимуляции выхода цитохрома с из митохондрий

ЛИЗОФОСФОЛИПИДЫ: (лиза-ФХ, лиза-ФК, лиза-свинголипиды) УЧАСТИЕ В КЛЕТОЧНЫХ ЭФФЕКТАХ, ИНИЦИИРУМЫХ МЕДИАТОРАМИ СООТВЕТСТВУЮЩИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОТВЕТЫ Специфические влияние разных лиза-ФЛ на митогенез (МАРК), пролиферацию, дифференциацию, миграцию клеток, влияние на апоптоз или жизнеспособность («анти- апоптоз») Сосудосуживающая активность, заживление ран, иммуномодуляция, ангиогенез, агрегация тромбоцитов и др.

СФИНГОМИЕЛИН: -источник биоактивных свинголипидов (церамиды, СФ-фосфат, СФ-фосфорхолин, клико-СФЛ) - контроль степени жесткости мембраны - участие в образовании рафтов и кавеол плазматических мембран

Схематическое изображение рафтов и кавеол плазматических мембран ( L. Pike, 2003).

- Создание условий для одновременной локализации различных компонентов специфических сигнальных путей - Контроль доступа других соединений к каждой сигнальной молекуле – за счет дифференцированной локализации - Специфическое влияние уникального фартового микроокружения на конформацию и активность сигнальных белков - Условия для специфических перекрестных связей между различными сигнальными путями благодаря локализации в одном липидном крафте. - Кластеризация или перемещение одного или нескольких типов липидных рафтов способствует: а) образованию высокоорганизованного сигнального комплекса, пространственно регулируемого при сигналинге б) транспортировке сигнальных комплексов к специфической области – мишени плазматической мембраны - «Негативная» регуляция сигналинга (прерывание передачи сигналов путем изоляции сигнальной молекулы)

Мембраны ядерной оболочки (NE) Хроматин Ядерный матрикс Общее количество липидов (мкг/мг белка) ~ 400~ 4

ХРОМАТИНЯДЕРНЫЙ МАТРИКС Печень Регенер. печень Опухоль ( асцит Эрлиха) Печень Регенер. печень Опухоль* СМ ФС361020,37-18 КЛ ФЭ Лизо-ФХ--9 ФК--6 * - приведены данные только для ФЛ, существенно отличающихся по сравнению с нормой **- средний диапазон значений из разных работ по 6 видам клеток опухолей (HeLaS3, эритролейкемия, асцит Эрлиха и др.)

УЧАСТИЕ ВНУТРИЯДЕРНЫХ ФОСФОЛИПИДОВ В РЕГУЛЯЦИИ РЕПЛИКАЦИИ И ТРАНСКРИПЦИИ ФУНКЦИЯФОСФОЛИПИДЫ «Со-локализация» и, возможно, функциональное связывание с РНК max - свингомиелин (СМ) фосфатидилсерин (ФС) Частичная иммобилизация молекулы ДНКmax - для смеси СМ + ФХ + ФЭ Дестабилизирующий эффект на структуру ДНК (возм. участие в инициации репликации) свингомиелин (СМ) Участие в связи ДНК с негистоновыми белками при репликации ДНК все фосфорлипиды (специфичность не указана) Участие в функциональном контакте петель ДНК с ядерным матриксом кардиолипин (КЛ); СМ (через свинг. группу) Контроль реакций конденсации – деконденсации хроматина анионные ФЛ – деконденс., цвитерионные - конденсация Специфич. действие на ядерные ферменты (РНК- и ДНК-полимеразы, топоизомеразы и др.) анионные ФЛ, специфично Нивелирование ингибирующего эффекта гистонов на транскрипцию и репликацию КЛ, ФГ – в транскрипции, КЛ, ФГ, ФС – в репликации

«Экспериментальные подходы в липидомных исследованиях» (по Wenk, 2005) Экспериментальные подходы Исследуемые классы липидов Достоинства Недостатки В КЛЕТКЕ: визуализация (imaging) флуоресцентных липидов Некоторые ФЛ, стерины Наблюдение сегрегации липидов в клетке Ограниченная коммерческая доступность, флуоресценция липидов, «помехи» из- за взаимодействия с др.группами БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ: Использование иммобилизаванных липидов (монослои, биосенсоры и т.д.) Многие липиды и их смеси Определение взаимодействия лигандов с липидами Технические трудности функциональной иммобилизации липидов, ограниченные возможности автоматизации Работа с липидными эмульсиями с последующими оптическими, колориметрическими, радиометрическими и др. подходами Многие липиды и их смеси Определение ферм. активности, мест связываения и пр. Трудности в оптимизации условий

(продолжение) Эксперименталь- ные подходы Исследуемые классы липидов Достоинства Недостатки ХРОМАТОГРАФИЯ ТСХБольшинство классов липидов с подбором систем растворителей Хорошо развитая, доступная техника; не треб. сложного оборудования Низкая чувствительность и разрешение; детекция липидных пятен – иодом, меткой, красителями ВЭЖХМногие классы липидов и их производные- стероиды, ЖК, ФЛ, ТГ, ДГ Хорошо развитая техника в условиях нормальной и обращенной фазы; количеств. определение Трудности детекции (отсутствие поглощения в видимом и УФ-свете для большинства липидов) МАСС- СПЕКТРОМЕТРИЯ МАЛДИМногие классы липидов, в т.ч. сложные кликолипиды Прямая детекция по m/z; возможна комбинация с ТСХ Низкая трудно контролируемая ионизация; неколичественная детекция «ЭЛЕКТРО-СПРЕЙ»В основном полярные липиды (ФЛ) Прямая детекция по m/z; высокая чувствительность и разрешение; анализ сложных смесей, сочетание с ЖХ Низкая ионизация; требование отдельной работы для количественного анализа (напр. внутр. стандарт)

СХЕМА НАПРАВЛЕНИЙ НАУЧНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЛИПИДНОГО КОНСОРЦИУМА LIPID MAPS ( Metabolites And Pathway Strategy) (США)