ПЕПТИДЫ И БЕЛКИ Спирали встречаются во многих областях: в архитектуре, в макромолекулах белков, нуклеиновых кислот и даже в полисахаридах (Loretto Chapel, Santa Fe, NM/© Sarbo )

2 У каждого вида организмов имеются тысячи различных белков, а число самих видов, вероятно, составляет около 10 миллионов. Можно ли всего из 20 аминокислот построить, скажем, (или более) различных последовательностей? Дипептид – 2 изомера Трипептид (из трех аминокислот – А, В и С) – 3!=1·2·3=6 изомеров (ABC, АСВ, ВАС, ВСА, CAB и СВА) ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О БЕЛКАХ

3 Тетрапептид - 4! = 4·3·2·1=24 различные последовательности Полипептида из 20 различных аминокислот – 20!2·10 18 изомеров (M r 2600). Белок с M r 34000, состоящий из 12 аминокислот в равных соотношениях, имеет возможных последовательностей. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О БЕЛКАХ

4 Garrett R.H., Grisham C.M. Biochemistry. 2ed., s.

5 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ

6 Garrett R.H., Grisham C.M. Biochemistry. 2ed., s.

7 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ

8 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Состав и аминокислотная последовательность) Молекулярные характеристики некоторых белков БелокМол. массаЧисло остатковЧисло цепей Инсулин (бычий) Рибонуклеаза (из поджелудочной железы быка) Лизоцим (из яичного белка) Миоглобин (из миокарда лошади) Химотрипсин (из поджелудочной железы быка) Гемоглобин (человека) Сывороточный альбумин (человека)68 500~5501 Гексокиназа (из дрожжей) ~8002 γ-Глобулин (лошади) ~12504 Глутаматдегидрогенеза (из печени быка) ~8300~40

9 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Выделение и очистка белков) Диализ Garrett R.H., Grisham C.M. Biochemistry. 2ed., s. Мембрана, окружающая раствор белка, свободно пропускает воду и низкомолекулярные соединения, такие, как NaCl или глюкоза, но не пропускает большие молекулы в частности молекулы белка. Малые молекулы диффундируют из диализного мешочка во внешний сосуд, так как в процессе диффузии молекулы стремятся перейти в зону с более низкой концентрацией. Заменяя несколько раз водную фазу во внешнем сосуде на дистиллированную воду, можно снизить концентрацию низкомолекулярных соединений в растворе белка до сколь угодно малой величины.

10 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Выделение и очистка белков) Гель-фильтрация Garrett R.H., Grisham C.M. Biochemistry. 2ed., s. Разделение белков в соответствии с размерами их молекул методом гель- фильтрации. Раствор, содержащий смесь белков, пропускают через колонку, заполненную очень мелкими пористыми гранулами гидрофильного полимера: широко используют для этой цели производные декстрана. Молекулы малых белков проникают внутрь гранул, тогда как более крупные молекулы не могут туда проникнуть. Молекулярную массу белка можно определить путем сравнения скорости его прохождения через колонку со скоростями прохождения других белков с известными молекулярными массами.

11 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Выделение и очистка белков) Гель-электрофорез Garrett R.H., Grisham C.M. Biochemistry. 2ed., s.

12 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Определение аминокислотной последовательности полипептидных цепей) Стадия 1: Определение аминокислотного состава

13 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Определение аминокислотной последовательности полипептидных цепей) Стадия 2: Идентификация амино- и карбокси- концевых остатков тетрапептид ФДНБ 2,4-динитрофенил- тетрапептид 2,4-динитрофенил- аминокислота смесь свободных аминокислот

14 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Определение аминокислотной последовательности полипептидных цепей) Стадия 2: Идентификация амино- и карбокси- концевых остатков дансилхлорид тетрапептид, Меченный дансилхлоридом

15 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Определение аминокислотной последовательности полипептидных цепей) Стадия 3: Расщепление полипептидной цепи на фрагменты Специфичность, свойственная четырем важным методам фрагментации полипептидных цепей Обработка Точки расщепления (остатки, которым принадлежит карбонильная группа расщепляемой пептидной связи) ТрипсинЛизин Аргинин ХимотрипсинФенилаланин Триптофан Тирозин ПепсинФенилаланин Триптофан Тирозин Некоторые другие остатки БромцианМетионин

16 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Определение аминокислотной последовательности полипептидных цепей) Стадия 3: Расщепление полипептидной цепи на фрагменты Garrett R.H., Grisham C.M. Biochemistry. 2ed., s.

17 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Определение аминокислотной последовательности полипептидных цепей) Стадия 3: Расщепление полипептидной цепи на фрагменты Активный центр химотрипсина а) в отсутствии субстрата

18 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Определение аминокислотной последовательности полипептидных цепей) Стадия 3: Расщепление полипептидной цепи на фрагменты Активный центр химотрипсина б) в присутствии субстрата

19 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Определение аминокислотной последовательности полипептидных цепей) Стадия 3: Расщепление полипептидной цепи на фрагменты Расщепление пептидной связи (стадия ацилирования)

20 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Определение аминокислотной последовательности полипептидных цепей) Стадия 3: Расщепление полипептидной цепи на фрагменты Стадия деацилирования

21 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Определение аминокислотной последовательности полипептидных цепей) Стадия 4: Определение последовательности пептидных фрагментов тетрапептид фенилизотиоцианат фенилтиокарбамоил- тетрапептид фенилтиогидантоиновое производное N-концевой аминокислоты исходный пептид минус N-концевой остаток

22 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Определение аминокислотной последовательности полипептидных цепей) Стадия 4: Определение последовательности пептидных фрагментов Garrett R.H., Grisham C.M. Biochemistry. 2ed., s.

23 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Определение аминокислотной последовательности полипептидных цепей) Стадия 5: Расщепление исходной полипептидной цепи еще одним способом Garrett R.H., Grisham C.M. Biochemistry. 2ed., s.

24 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Определение аминокислотной последовательности полипептидных цепей) Стадия 6: Установление порядка расположения пептидных фрагментов по перекрывающимся участкам Garrett R.H., Grisham C.M. Biochemistry. 2ed., s.

25 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Определение аминокислотной последовательности полипептидных цепей)

26 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Определение аминокислотной последовательности полипептидных цепей) Аминокислотная последовательность, т.е. порядок чередования -аминокислотных остатков, составляет первичную структуру пептидов и белков.

27 СТРОЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ПЕПТИДОВ

28 Дипептиды Каркозин ( -аланил-L-гистидин) Ансерин ( -аланил-N-метил-L-гистидин) СТРОЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ПЕПТИДОВ

29 Трипептиды СТРОЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ПЕПТИДОВ

30 Трипептиды СТРОЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ПЕПТИДОВ

31 Пептидные антибиотики Bacillus brevis Г.Ф. Граузе и М.Г. Бражникова (1942) L-орнитин СТРОЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ПЕПТИДОВ

32 Пептидные гормоны В. Дю Виньо (1953 г.) СТРОЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ПЕПТИДОВ

33 Пептидные гормоны Ф. Сенгер (1943 г.) M r =5727 С 259 Н 377 N 65 O 75 S 6 СТРОЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ПЕПТИДОВ инсулин

34 Пептидные токсины СТРОЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ПЕПТИДОВ

35 Нейропептиды СТРОЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ПЕПТИДОВ

36 СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ

37 СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ

38 СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ Синтез дипептида аланилвалина 1-ый компонент – Аланин Защита NH 2 -группы:

39 СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ Синтез дипептида аланилвалина 1-ый компонент – Аланин Активация COOH-группы:

40 СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ Синтез дипептида аланилвалина 2-ый компонент – Валин Защита COOH-группы:

41 СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ Синтез дипептида аланилвалина Образование амидной связи

42 СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ Твердофазный синтез пептидов Меррифилд Б. (1962)

43 СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ Твердофазный синтез пептидов Меррифилд Б. (1962) Garrett R.H., Grisham C.M. Biochemistry. 2ed., s.

44 СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ Твердофазный синтез пептидов Меррифилд Б. (1962) Этим методом были синтезированы цепи А и Б инсулина (1967), апоферритин (1968), рибонуклеаза А (1969). В синтезе рибонуклеазы были соединены 124 аминокислотных остатка, что потребовало проведения 369 химических реакций и 1131 автоматических операций (промывки и т. п.) без промежуточного выделения продуктов. ЖИДКОФАЗНЫЙ СИНТЕЗ Акад. М.М. Шемякин

45 СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ Applied Biosystems model 430A peptide synthesizer

46 СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ Biosearch Peptide Synthesizer (New Brunswick) model 9600

47 СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ ABI model 431a peptide synthesizer, made by applied Biosystems

48 СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ Applied Biosystems 433A Peptide Synthesizer

49 СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ Applied Biosystems 433A Peptide Synthesizer

50 СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ Applied Biosystems 433A Peptide Synthesizer

51 СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ Applied Biosystems 433A Peptide Synthesizer

52 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Строение пептидной группы)

53 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Строение пептидной группы) Garrett R.H., Grisham C.M. Biochemistry. 2ed., s.

54 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Строение пептидной группы)

55 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Строение пептидной группы) Garrett R.H., Grisham C.M. Biochemistry. 2ed., s.

56 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Строение пептидной группы)

57 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Вторичная структура – α-спираль)

58 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Вторичная структура – α-спираль)

59 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Вторичная структура – α-спираль)

60 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Вторичная структура – α-спираль)

61 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Вторичная структура – β-складчатые структуры) ПараллельныйАнтипараллельный складчатые листы

62 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Вторичная структура – β-складчатые структуры) Вторичная структура полипептидной цепи в виде складчатого листа ( -структура)

63 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Вторичная структура – β-складчатые структуры)

64 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Третичная структура) Фибрилярные белки Глобулярные белки

65 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Третичная структура)

66 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Третичная структура)

67 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Третичная структура)

68 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Фибриллярные белки) Коллаген

69 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Фибриллярные белки) Модель строения спирали коллагена

70 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Фибриллярные белки) "Сшивание" тропоколлагеновых цепей в коллагене

71 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Фибриллярные белки) "Сшивание" тропоколлагеновых цепей в коллагене

72 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Фибриллярные белки) α-Кератин α-спираль Волокно (четыре правосторонних искривленных протофибрилы) Две α-спирали

73 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Фибриллярные белки) α-Кератин Структура волоса и входящего в его состав α-кератина. Основным элементом структуры служит полипептидная цепь α-кератина в нативной α-спиральной конформации. Три α-спиральные цепи образуют скрученный (суперспирализованный) трехжильный «канат»; 11 таких канатов составляют микрофибриллу волоса.

74 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Фибриллярные белки) β-Кератин фиброин β-Конформация полипептидных цепей в β- кератинах. А. Три цепи, образующие складчатый слой (вид сверху); показано расположение поперечных водородных связей между соседними цепями. R-группы выделены красным цветом. Б. Та же структура (вид сбоку): показано расположение R-групп, выступающих по обе стороны складчатого слоя.

75 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Фибриллярные белки) Перманентная завивка волос – пример биохимической технологии Последовательные стадии перманентной завивки волос. А. В прямом волосе α- спиральные витки кератина выстроены в одну прямую линию и стабилизированы поперечными дисульфидными связями. Б. Для того чтобы сделать волосы вьющимися, поперечные связи разрушают восстанавливающим агентом, под действием которого дисульфидные связи цистина превращаются в тиоловые группы остатков цистеина, расположенных в двух соседних цепях. В. Волосы механически изгибают, накручивая их на специальные трубочки. При изгибании полипептидных цепей соответствующие друг другу тиоловые группы смещаются. Г. При окислении SH-rpynn возникают новые поперечные цистиновые связи; они и делают образовавшиеся завитки волос «перманентными».

76 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Глобулярные белки)

77 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Глобулярные белки) Лизоцим 1965 г. 129 аминокислотных остатков Mr =

78 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Денатурация и ренатурация)

79 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ (Четвертичная структура) Гемоглобин