12. Вклад рентгеноструктурного анализа в изучение структуры и функции ферментов Физико-химические основы биокатализа в иллюстрациях 12. Вклад рентгеноструктурного анализа в изучение структуры и функции ферментов (изучение нуклеотидсвязывающих ферментов, оксидоредуктаз, ДНК-полимераз и других белков)

Метод рентгеноструктурного анализа (РСА) – один из основных методов исследования структуры и функций ферментов и их активных центров Последние 20 лет метод РСА интенсивно развивался благодаря: 1.улучшению качества очистки белков, 2.оптимизации методов кристаллизации белков, 3.улучшению технического оснащения РСА и, в связи с глобальной компьютеризацией, внедрению машинной и компьютерной обработки данных. На заре использования РСА для кристаллизации требовалось порядка 100 мг белка, на сегодняшний день требуется не более 10 мг.

Проблемы метода РСА Получение необходимого количества анализируемого белка: получают рекомбинантную молекулу ДНК, встраивают конструкцию, кодирующую целевой белок, в клетки E.сoli или бакуловируса, и инициируют направленную экспрессию требуемого белка, очищают белок от примесей. Некоторые белки трудно экспрессировать с помощью рекомбинантных молекул, в частности, может возникнуть проблема сборки многосубъединичных белков. Некоторые белки трудно экспрессировать с помощью рекомбинантных молекул, в частности, может возникнуть проблема сборки многосубъединичных белков. Можно столкнуться с другой трудностью, в процессе очистки целевой белок бывает трудно отделить от примесей без значительных потерь. Можно столкнуться с другой трудностью, в процессе очистки целевой белок бывает трудно отделить от примесей без значительных потерь. Многие белки, качественно очищенные, бывает трудно закристаллизовать. Многие белки, качественно очищенные, бывает трудно закристаллизовать.

Выявляемые с помощью РСА молекулярные структуры и соответствующее разрешение Разрешение, ǺВыявляемая структура 5,5 Общая конфигурация молекулы. Спирали в виде интенсивно рассеивающих лучи палочек 3,5 Полипептидный остов, не четко 3,0 Боковые цепи, не четко 2,5 Разрешение боковых цепей, плоскости пептидной группы. Расположение атомов определено с точностью +0,4 Ǻ 1,5 Расположение атомов определено с точностью +0,1 Ǻ

Панкреатическая рибонуклеаза (РНКаза) Панкреатическая рибонуклеаза (РНКаза) является первым ферментом, для которого У. Стайн и С. Мур в 1960 г. установили полностью первичную структуру. Уильям Говард Стайн 1911 – 1980, Нью-Йорк, США биохимик Нобелевская премия по химии 1972 г. Станфорд Мур 1913, Чикаго , Нью-Йорк, США биохимик Нобелевская премия по химии 1972 г.

Панкреатическая рибонуклеаза (РНКаза) На основании результатов исследования ренатурации рибонуклеазы К. Анфинсен впервые в 1960 г. четко сформулировал представление о том, что пространственное строение белка определяется его первичной структурой. Рибонуклеаза гидролизует межнуклеотидные связи в РНК около пиримидиновых звеньев, которые при этом остаются этерифицированными по 3'-положению. Механизм реакции, катализируемой рибонуклеазой, расшифрован с помощью методов РСА, ЯМР и химической модификации. Кристиан Бемер Анфинсен 1916, Монессен, США американский биохимик Нобелевская премия по химии 1972 г.

Карбоксипептидаза А Пространственная структура фермента и его комплекса с дипептидом Gly-Tyr как с моделью субстрата была установлена с разрешением 2 Ǻ в 1967 г. При сравнительном анализе структур фермента и его каталитического прокомплекса с дипептидом Gly-Туг была получена важная информация о строении фермент-субстратного комплекса. В частности, установлено, что при образовании комплекса гидроксильная группа Туг248 перемещается на 1,2 нм по отношению к своему положению в свободном ферменте (т. е. примерно на 1/3 диаметра молекулы). Уильям Липскомб 1919, Кливленд – 2011, Кембридж, США Химик Нобелевская премия по химии 1972 г.

Предположительная роль остатка Tyr248 в реакции гидролиза дипептида, катализируемой карбоксипептидазой А

Схема активного центра карбоксипептидазы А в присутствии субстрата

Химотрипсин Трехмерная структура химотрипсина с разрешением 2 Ǻ была установлена методом РСА в 1976 г. Первичная структура фермента установлена Б. Хартли в 1964 г. Результаты кристаллографических исследований подтвердили предположение, сделанное с помощью необратимых ингибиторов, о том, что остатки Ser195 и His57 сближены. Следует отметить, что химические исследования не могли выявить участия Asp102 в функционировании активного центра, поскольку этот остаток погружен внутрь молекулы. В настоящее время считается, что три остатка Asp102, His57 и Ser195 образуют систему переноса заряда, которая играет решающую роль в процессе катализа. Дэвид Мэрвин Блоу 1931, Бирмингем – 2004, Эпплдор Английский биофизик

Томас Артур Стэйтц 1940, США биохимик и биофизик Нобелевская премия по химии 2009 г. за структуру большой 50S субчастицы рибосомы Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli Первой ДНК-полимеразой, которая была закристаллизована, был фрагмент Кленова ДНК- полимеразы I E. coli. Фрагмент Кленова лишен 5-3 экзонуклеазного домена ДНК- полимеразы I, и обладает двумя активностями: ДНК-полимеризующей и 3-5 экзонуклеазной. РСА фрагмента Кленова впервые обнаружил специфическую архитектуру полимеразного домена, который по форме напоминает кисть правой руки и состоит из пространственных доменов «ладонь», «большой палец», прижимающий праймер-матричный двунитевой участок, и «пальцы», которые удерживают однонитевую матрицу.

Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli Аналогичную трехмерную организацию «правой руки» имеют полимеразные домены других ДНК-полимераз и обратной транскриптазы (ревертазы) ВИЧ. РСА позволяет детализировать и модифицировать эту модель применительно к различным типам ДНК-полимераз эукариот. Наиболее консервативна топология домена «ладонь». В целом, для архитектуры полимеразного домена характерно существование внутренней полости для связывания ДНК и входящего dNTP, основанием которой является домен «ладонь». Схема связывания фрагментом Кленова ДНК в полимеразном активном центре (слева) и экзонуклеазном активном центре (справа). При переходе из полимеразного в экзонуклеазный активный центр фермент перемещается на 4 пары нуклеотидов двуцепочечной ДНК и 4 нуклеотида с 3-конца одноцепочечной неспаренной части.

«Cтруктурные мотивы» в глобулярных белках – характерные сочетания α-спиралей и β-структур α/β цилиндр Складка Россмана в триозофосфатизомеразе в NAD-связывающем домене малатдегидрогеназы

алкилирующие агенты O6-meG прямая репарация УФ-излучение мутагены окружающей среды пиримидиновые димеры крупные аддукты репарация нуклеотидов рентгеновское излучение двойные разрывы репарация двойных разрывов ДНК ошибки репликации неправильное спаривание оснований вставки, делеции репарация неправильно спаренных оснований Механизмы повреждений и репарации ДНК спонтанные реакции эндогенные окислители активные формы кислорода апуриновые/апиримидиновые (АР-) сайты окисленные дезаминированные и алкилированные основания однонитевые разрывы репарация оснований

Дефекты систем репарации ДНК Рак Старение Катаракта Прогрессивный церебральный паралич Умственная и иммунная недостаточность Синдром Коккейна Пигментная ксеродерма (меланома, карцинома) Трихотио- дистрофия

Действие используемых в клинике антираковых препаратов и экзогенных факторов (ионизирующая радиация, цисплатина, алкилирующие агенты) основано на повреждении ДНК и нивелируется системами репарации. Поэтому избирательное ингибирование репарации улучшает терапевтические эффекты. Системы репарации являются мишенями для создания новых лекарств

Репарация оснований Х ДНК гликозилаза Активные формы кислорода метилирование, дезаминирование Спонтанный гидролиз гликозидной связи (АР-сайт) Рентгеновское излучение (одноцепочечный разрыв) АР-эндонуклеаза 1 (APE1) PNK Поли(ADP-рибозо) полимераза 1 (PARP1) XRCC1 Pol +dGTP +4dNTP PCNA Pol / ε FEN1 ДНК- лигаза III ДНК- лигаза I +ATP

XRCC1 ДНК-лигаза III Pol XRCC1 АРЕ1 ДНК-лигаза III Pol ДНК-гликозилаза Pol XRCC1 X dGTP XRCC1 ATP Репарация оснований

Первичные дифракционные картины кристаллов Рol β, полученные на лабораторном дифрактометре (А) и на станции «Белковая кристаллография» (Б). Кристаллографические исследования выполнены ЛБХФ ИХБФМ СО РАН в рамках междисциплинарного интеграционного проекта СО РАН на белковой станции ИЯФ СО РАН (А) и на лабораторном дифрактометре НОЦ МДЭБТ НГУ (Б)

Общий вид трехмерных структур комплексов ДНК-гликозилаз с модельными ДНК-субстратами Lau coauth, Cell, 1998, 95, 249–258. Bruner coauth, Nature, 2000, 403, 859–866. Parker coauth,Nature, 2007, 449, 433–437.

Трехмерная структура комплекса АРЕ1 человека с продуктом катализируемой этим ферментом реакции Показаны две проекции модели (Mol coauth, Nature, 2000, 403, 451–456). Справа – фрагмент схемы репарации ДНК с участием АРЕ1.

Трехмерная структура комплекса ДНК-полимеразы β человека с субстратами Приведена структура комплекса с субстратами: дезоксицитидин- 5-трифосфатом и двуцепочечной ДНК, содержащей в одной из цепей однонуклеотидную брешь (Sawaya coauth, Biochemistry, 1997, 36, 11205–11215 ). Справа – фрагмент схемы репарации ДНК с участием ДНК-полимеразы β (Pol β).

Структура комплексов восстановленной (А) и окисленной (Б) форм фрагмента XRCC1 с ДНК-полимеразой β (Pol β) Показаны остатки цистеина, ответственные за структурные перестройки разных форм XRCC1, и электростатический потенциал на поверхности соответствующих форм белка (Cuneo and London, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010, 107, 6805–6810).

Трехмерные структуры флэп-эндонуклеазы 1 ( FEN1 ) и ДНК-лигазы I в комплексах с ДНК-субстратами А.Chapados coauth, Cell, 2004, 116, 39–50. Б.Pascal coauth, Nature, 2004, 432, 473–478.

Трехмерная структура каталитического домена PARP1 Iwashita coauth, FEBS Lett., 2005, 579, 1389–1393.

Схема репарации поврежденных нуклеотидов ДНК Gillet and Schärer, Chem Rev., 2006, 106, 253–276

Строение малой субчастицы рибосомы по данным РСА Полипептидные цепи рибосомных белков выделены разными цветами, полинуклеотидные цепи рРНК показаны серым цветом (Yusupov coauth, Science, 2001, 292, 883–896).