Транскрипция - это синтез всех видов РНК по матрице ДНК, осуществляемый ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Молекула ДНК, хранящая генетическую информацию, непосредственного участия в синтезе белка не принимает, но информация, записанная в последовательности нуклеотидов ДНК копируются (транскрибируются) в виде м-РНК с последующей трансляцией в полипептидную цепь белка. Транскрипция, как и репликация ДНК, - эндоэргический процесс, сопряженный с использованием нуклеозидтрифосфатов (АТФ, ГТФ, УТФ, ЦТФ) в качестве субстратов и источников энергии. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ ТРАНСКРИПЦИИ РНК синтезируется комплементарно и антипараллельно транскрибируемой цепи ДНК. Рост цепи РНК идет только в направлении 5' 3'. Для начала синтеза РНК фермент не нуждается в поли- или олигонуклеотидной затравке. Цепь ДНК, на которой идет трансрипция, называется кодирующей, другая - некодирующей. Участок ДНК, подвергающийся транскрипции, называется транскриптон (эукариоты) или оперон (прокариоты) ( нуклеотидов) Принципы транскрипции: Комплементарность. Антипараллельность. Униполярность. Беззатравочность. Асимметричность. Промотор - участок оперона, служащий для узнавания ферментом РНК- полимеразой. Последовательность оснований по ходу цепи ДНК ниже сайта промотора с направлением 3 5 используется в качестве матрицы для синтеза РНК. К промотору может присоединяться комплекс цАМФ-БАК (белок-активатор катаболитного гена), который облегчает РНК-полимеразе начало транскрипции структурных генов. Структура оперона

Особенности структуры промотора Узнавание и прочное связывание происходит на разных участках ДНК. Эти участки отличаются и по первичной, и по вторичной структуре. Путем секвенирования выявили структуру многих промоторов. У большинства из них имеется общее свойство. РНК-полимераза узнает промотор, покрывая пар нуклеотидов. В промоторе узнается взаимное расположение двух AT-богатых участков. В каждом из них 4-6 пар нуклеотидов. Центры этих участков находятся в положениях "-10" и "-35". Принципиально важным является расстояние между этими участками. Оно колеблется от 16 до 19 п.н. Искусственное увеличение этого расстояния до 20 п.н. или уменьшение его до 15 п.н. приводит к тому, что РНК- полимераза не узнает испорченный промотор. После промотора в опероне находится акцепторная зона (у эукариот) или оператор (у прокариот), которая служит для связывания с регуляторами транскрипции (например, усилительями - энхансерами). У оператора диспечерская функция: он разрешает или запрещает транскрипцию.

Гены или структурные цистроны - несут информацию о структуре полипептидных цепей или нематричных РНК. Транскриптон может содержать один структурный ген или несколько. Цистрон - последовательность нуклеотидов ДНК, кодирующая один полипептид (в большинстве случаев - белок) или одну tРНК, или одну rРНК. В большинстве случаев цистроны объединяются в оперон по следующему принципу: закодированные в них белки принимают участие в одной биохимической цепи реакций. Гены содержат интроны - неинформативные участки и экзоны - информатмивные участки. Терминатор - последний участок транскриптона, служит сигналом об окончании транскрипции. Первичный транскрипт - РНК, образующаяся при транскрипции - комплементарная копия транскриптона от промотора до терминатора.

На всех этапах транскрипции необходимо участие специальных белковых факторов: А, В - инициации, Е, Н, F - элонгации, ρ-фактор - терминации. 1. Инициация Присоединение ДНК-зависимой РНК-полимеразы к промотору. ЭТАПЫ ТРАНСКРИПЦИИ Непосредственно инициация синтеза начинается с включения в цепь первого нуклеотида - у всех РНК это пуриновый нуклеозидтрифосфат (Пур-5-ФФФ). На этом этапе действуют ингибиторы - антибактериальные антибиотики рифамицин и рифампицин, а также противоопухолевый антибиотик актиномицин D 2. Элонгация Высвобождение σ-фактора и скольжение РНК-полимеразы вдоль матрицы ДНК антипараллельно матрице в направлении 5 3. Фермент шаг за щагом полимеризует рибонуклеотиды, используя в качестве субстратов нуклеозидтрифосфаты (АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ), в определенной последовательности в соответствии со струтурой матрицы (ДНК) по принципу комплементарности. По мере продвижения кор-фермента происходит расплетание ДНК (впереди движения фермента) и переписывание кодирующей цепи ДНК, в результате чего образуется гибрид ДНК-РНК. Эукариотические клетки обычно содержат 3 типа РНК-полимераз: РНК-полимераза I катализирует синтез рРНК, РНК-полимераза II катализирует синтез пре-мРНК РНК-полимераза III катализирует синтез тРНК У прокариот этот фермент состоит из 4 субъединиц, образующих кор- фермент (сердцевина), к которому присоединяется дополнительный белковый σ-фактор, способствующий более прочному связыванию фермента со специфической промоторной последовательностью.

На этом этапе действует ингибитор элонгации - стрептолидигин 3. Терминация Сигнал терминации представляет собой определенную последовательность в рамках кодирующей цепи ДНК. Специфичными для терминирующих участков являются палиндромы - обратные повторы и пол и А-последовательности. Транскрипт с этого участка имеет форму шпильки с концевой УУУУ-последовательностью. На этом этапе участвует терминирующий белок - ρ -ф актор. После терминации кор-фермент отделяется от ДНК-матрицы и, связавшись с новой молекулой сигма-фактора, приступает к синтезу новой молекулы РНК. При взаимидействии ρ- фактора с РНК-полимеразой она теряет сродство к ДНК и комплекс распадается: фермент отделяется от ДНК, высвобождаются фактор и и первичный транскрипт, т.е. РНК

Все первичные транскрипты РНК у эукариот подвергаются процессингу (созреванию) в период между их синтезом и началом реализации соответствующей функции - в роли мРНК, тРНК или рРНК. Процессинг - сложный процесс, включающий кэпирование, реакции расщепления и лигирования (сплайсинг), присоединение дополнительных концевых нуклеотидов и нуклеозидную модификацию Кэпирование - присоединение к 5- концу мРНК метилгуанозинтрифосфата (связь 5-5), происходит в ядре, в процессе элонгации, когда длина цепи РНК достигает около 30 нуклеотидов. Полиаденилирование - присоединение концевых нуклеотидов - полиА- последовательность с 3-конца (происходит в ядре и цитоплазме), состоящая из остатков АМФ. Сплайсинг – вырезание интронов и сшивание экзонов

Информационная емкость ДНК На Земле живет 6 миллиардов человек. Наследственная информация о них заключена в 6х10 9 сперматозоидах. По разным оценкам у человека от 30 до 50 тысяч генов. У всех людей ~ 30х10 13 генов или 30х10 16 пар нуклеотидов, которые составляют кодонов. Средняя книжная страница содержит 25х10 2 знаков. ДНК 6х10 9 сперматозоидов содержит информацию, равную по объему примерно 4х10 13 книжных страниц. Эти страницы заняли бы объем 6-и зданий М ГУ. 6х10 9 сперматозоидов занимают половину наперстка. Их ДНК занимает менее четверти наперстка. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД Генетический код - это система записи информации о последовательности расположения аминокислот в белках с помощью последовательности расположения нуклеотидов в ДНК. Свойства кода - триплетность (4 3 =64 кодона) - специфичность (один кодон - одна аминокислота) - вырожденность (на одну аминокислоту - несколько кодонов) - универсальность - однонаправленность (5---->3) - непрерывность - неперекрываемость - линейность

Благодаря антикодону -триплету в средней часити молекулы тРНК, комплементарному определенному кодону на мРНК, тРНК читает текст на м-РНК, а с помощью акцепторного участка на 3-конце - ЦЦА ( обязательного для всех т-РНК) - присоединяет соответствующую аминокислоту с образованием аминоацил-тРНК. 1 этап: Активация и узнавание аминокислот ТРАНСЛЯЦИЯ - БИОСИНТЕЗ БЕЛКА Трансляция- это перевод генетического текста мРНК в линейную последовательность аминокислот в полипептидной цепи белка. Специфическое взаимное узнавание аминокислоты и тРНК происходит с помощью фермента - аминоацил-тРНК-синтетазы (АРС-азы). Этот фермент узнает и связывает тРНК, а затем переносит аминокислотный остаток на 3-ОН группу концевого аденозина, присоединяя ее сложно - эфирной связью: аминокислота + тРНК + ATP аминоацил-тРНК + АМР + РР аа-тРНК-синтетаза Чтобы аминокислота «узнала» свое место в будущей полипепетидной цепи, она должна связаться с транспортной РНК (тРНК), выполняющей адапторную функцию: с одной стороны, «узнает» кодон на мРНК, с другой – связывается с соответствующей этому кодону аминокислотой. Все т-РНК имеют одну полинуклеотидную цепь, отдельные участки которой образуют спиралевидные петли - шпильки за счет водородных связей А-Т и Г – Ц ( 70% п/п цепи), в результате образуется пространственная конфигурация в виде клеверного листа.

Компоненты: м-РНК - генетическая матрица - содержит линейную последовательность кодонов, определяющих первичную структуру белков набор (около 60 ) аа-т-РНК - для чтения текста на м-РНК и как источник аминокислот при сборке белка. Выполняет функцию адаптора, переводящего запись информации с языка нуклеотидов на язык аминокислот АТФ, ГТФ - источники энергии белковые факторы инициации, элонгации, терминации - специфические внерибосомные белки, необходимые для процессов трансляции ионы магния - стабилизируют структуру рибосом рибосомы - рибонуклеопротеиновые субклеточные структуры, являющиеся местом синтеза белков - молекулярные машины для последовательного соединения аминокислот. В состав рибосом входит р ибосомальная РНК (рРНК), окруженная белками. Рибосомы с осто я т из 2 неравных субъ единиц. Наход я тся в свободном состоянии в цитоплазме или связаны с мембранами эндоплазматического ретикулума. Могут свободно перемещаться в различные участки клетки ----> собирать белок там, где необходимо. Прокариотическая рибосома Эукариотическая рибосома 70S80S 50S30S60S40S 5S rРНК 23S rРНК 16S rРНК 5S rРНК 5.8S rРНК 28S rРНК 18S rРНК 34 молекул белков 21 белок не менее 50 разных белков не менее 33 разных белков В синтезе белка мРНК использует не одну, а несколько рибосом ---> образуются полисомы --> повышается эффективность использования мРНК ----> повышается скорость синтеза белка. 2 этап: Собственно биосинтез белка Рибосомы и их субъединицы классифицируют не по массам, а в соответствии с коэффициентами седиметации (S), которые определяются ультрацентрифугированием

Субчастицы рибосом разомкнуты. М-РНК, выйдя из ядра, связывается с малой субъединицей рядом с 5 концом м-РНК (чтение от 5---->3). В пределах субчастицы помещается 2 кодона. Первый кодон АУГ или ГУГ - инициирующие, если они находятся в начале цепи, если в середине - то они кодируют метионин или валин соответственно. Белковые факторы инициации обеспечивают связывание м-РНК с субчастицей рибосомы и ГТФ, затем присоединяется большая субъединица, а факторы удаляются. Образуется комплекс: м-РНК-рибосома-метионил-т-РНК, готовый к элонгации. 1. ИНИЦИАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ На рибосоме имеются два участка: П-сайт или пептидильный сайт, служащий для связывания с удлиняющейся полипептидной цепью, А-сайт или аминоацильный, служащий для присоединения новой аатРНК. На стадии инициации к П-сайту присоединяется метионил-тРНК, А-сайт – свободен. метионил-тРНК мРНК П-сайт А-сайт

Элонгация - это рост полипептидной цепи от N-конца к С-концу а) - связывание аа-т-РНК В момент первого шага второй кодон на мРНК свободен. С ним спаривается своим антикодоном поступающая в рибосомы аа-тРНК, ее аминоацильный конец связывается с А-сайтом рибосомы. На это расходуется энергия ГТФ. Участвуют белковые факторы элонгации. б) -транспептидация Происходит переброс пептидила с левой тРНК (из П -сайта) на аминогруппу аа- тРНК ----> образуется пептидная связь с помощью фермента пептидилтрансферазы. В А -сайте образуется пептидил-тРНК (n+1), П -сайт - вакантный. в) - транслокация Образовавшийся пептидил-тРНК переносится из А -сайта в П -сайт, благодаря продвижению рибосомы относительно мРНК. Фермент - транслоказа. И спользуется энергия ГТФ. Риб о сома перемещается вдоль мРНК в направлении 3-конца на 1 кодон (триплет) ----> идет наращивание цепи по 1 аминокислоте в соответствии с порядком кодонов мРНК. Энергетические затраты на синтез 1 пептидной связи: 2АТФ и 2 ГТФ 2. ЭЛОНГАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ

В мРНК присутствуют терминирующие кодоны (стоп-сигналы) УАА. УГА. УАГ и белковые факторы терминации. С терминирующими кодонами не может связаться ни одна тРНК, т.к. нет соответствующих антикодонов---> идет связывание с белковыми факторами терминации. Активируются рибосомные белки - пептидазы -----> гидролизуется сложноэфирная связь между синтезированным полипептидом и тРНК -> отделяется синтезированный белок от рибосомы, освобождается тРНК и мРНК. 3. ТЕРМИНАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ Регуляция синтеза белка Концентрация многих белков в клетке непостоянна и изменяется в зависимости от состояния клетки и внешних условий. Это происходит в результате регуляции скоростей синтеза и распада белков. Регуляция экспрессии генов может осуществляться на любой стадии на пути от гена до образования функционально-активного белка. Регуляция транскрипции Транскрипция генов может подавляться или активироваться, следовательно, синтез белков может репрессироваться или индуцироваться. Оперон - это участок DNA, кодирующий строение, как правило, функционально связанных белков и содержащий регуляторную зону, контролирующую синтез этих белков. На рисунке приведена схема лактозного оперона:

Действие антибиотиков на биосинтез белка