Д. А. Равчеев Регуляция транскрипции в прокариотах Факультет Биоинженерии и Биоинформатики, Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова Учебно-научный центр Биоинформатика Институт Проблем Передачи Информации РАН Изучение методами сравнительной геномики

Изучение регуляции методами сравнительной геномики Поиск потенциальных регуляторных последовательностей Пример: сайты связывания факторов транскрипции Что дает изучение регуляции с помощью сравнительной геномики Полезно для функциональной аннотации и метаболической реконструкции Интересно само по себе Исследование эволюции

Обучающая выборка – набор сайтов (обычно экспериментально определенных), на основании которого строится представление о структуре сигнала. purL tccACGCAAACGGTTTCGTcag cvpA cctACGCAAACGTTTTCTTttt purC gatACGCAAACGTGTGCGTctg purH gttGCGCAAACGTTTTCGTtac purR taaAGGCAAACGTTTACCTtgc prsA cgcAAGAAAACGTTTTCGCgag codB cccACGAAAACGATTGCTTttt purE gccACGCAACCGTTTTCCTtgc purM gtcTCGCAAACGTTTGCTTtcc ГенСайт Обучающая выборка : Пример: ACGCAAACGTTTGCGT Консенсусная последовательность : Поиск потенциального сайта в геномной последовательности : carA atgcaatcttcttgctgCGCAAgCGTTTtCcagaacaggttagatgatctttttgtcgctt ACGCAAACGTTTGCGT 11 нуклеотидов из 16 совпадают с консенсусом Поиск потенциальных регуляторных сайтов Поиск по консенсусу

Поиск потенциальных регуляторных сайтов Поиск по консенсусу Недостатки метода: 1. Не учитывается разная значимость позиций Абсолютно консервативная позиция Консервативная позиция с малым числом замен Слабо консервативная позиция 2. Не учитывается разность частот нуклеотидов в одной позиции А – 11%С – 0% G – 33%T – 56% ACGCAAACGGTTTCGT ACGCAAACGTTTTCTT ACGCAAACGTGTGCGT GCGCAAACGTTTTCGT AGGCAAACGTTTACCT AAGAAAACGTTTTCGC ACGAAAACGATTGCTT ACGCAACCGTTTTCCT TCGCAAACGTTTGCTT

Поиск потенциальных регуляторных сайтов Матрицы позиционных весов Обучающая выборка : purL ACGCAAACGGTTTCGT cvpA ACGCAAACGTTTTCTT purC ACGCAAACGTGTGCGT purH GCGCAAACGTTTTCGT purR AGGCAAACGTTTACCT prsA AAGAAAACGTTTTCGC codB ACGAAAACGATTGCTT purE ACGCAACCGTTTTCCT purM TCGCAAACGTTTGCTT Вес каждого нуклеотида в каждой позиции : Характеризует встречаемость данного нуклеотида в данной позиции Характеризует консервативность данной позиции Консенсус : ACGCAAACGTTTGCGT N (b,k) позиция A C G T Матрица (фрагмент) a c g t

Поиск потенциальных регуляторных сайтов Матрицы позиционных весов Поиск потенциального сайта в геномной последовательности : carA atgcaatcttcttgctGCGCAAGCGTTTTCCAgaacaggttagatgatctttttgtcgctt a c g t позиция Вес найденного сайта : 4,57 Вес сайта : Недостаток метода : ложные предсказания сайтов, вызванные случайным сходством последовательностей

Поиск потенциальных регуляторных сайтов Распознающее правило Матрица позиционных весов Область поиска сайтов как привило, в потенциальной реуляторной области гена: … +100 п.н. от старта трансляции. Пороговое значение для веса сайта а) Минимальный вес сайтов из обучающей выборки 6,23 5,94 5,81 5,79 5,78 5,55 5,53 5,32 cvpA purL purH purC purM purE codB purR prsA ACGCAAACGTTTTCTT ACGCAAACGGTTTCGT GCGCAAACGTTTTCGT ACGCAAACGTGTGCGT TCGCAAACGTTTGCTT ACGCAACCGTTTTCCT ACGAAAACGATTGCTT AGGCAAACGTTTACCT AAGAAAACGTTTTCGC Ген Сайт Вес пороговое значение Сайты из обучающей выборки, оцененные по матрице весов б) В соответствии с ожидаемым размером регулона

Сравнительный подход к изучению регуляции Метод проверки соответствия Базовый геном гены сайты

Сравнительный подход к изучению регуляции Метод проверки соответствия Другие геномы Ген регулируется Базовый геном

Другие геномы Ген регулируетсяГен НЕ регулируется Базовый геном Сравнительный подход к изучению регуляции Метод проверки соответствия

Другие геномы Ген регулируетсяГен НЕ регулируется ? Базовый геном Сравнительный подход к изучению регуляции Метод проверки соответствия

Сравнительный подход к изучению регуляции Ключевые понятия Регулон (Regulon) группа генов, непосредственно регулирующихся одной регуляторной системой в одном организме Обобщенный регулон (Regulog) группа генов, непосредственно регулирующихся одной регуляторной системой в группе родственных организмов

Сравнительный подход к изучению регуляции Ключевые понятия Геном 1 Регулон 1 Геном 2 Геном 3 Геном 4 Регулон 2 Регулон 3 Регулон 4

Сравнительный подход к изучению регуляции Ключевые понятия Геном 1 Регулон 1 Геном 2 Геном 3 Геном 4 Регулон 2 Регулон 3 Регулон 4 Обобщенный регулон

Сравнительный подход к изучению регуляции Ключевые понятия Геном 1 Регулон 1 Геном 2 Геном 3 Геном 4 Регулон 2 Регулон 3 Регулон 4 Обобщенный регулон Ядро обобщенного регулона

Открытие BioY, транспортера биотина Исследование обобщенного BirA-регулона Биотин (витамин Н) – кофактор ферментов карбоксилаз и декарбоксилаз, служит переносчиком карбоксильных групп BirA – фактор транскрипции, репрессор, регулятор генов биосинтеза биотина Rodionov D.A., Mironov A.A., Gelfand M.S. (2002) Conservation of the biotin regulon and the BirA regulatory signal in Eubacteria and Archaea. Genome Res. 12 (10) Исследование BirA-зависимой регуляции в прокариотах : Бациллы Клостридии Актинобактерии Зеленые серные бактерии Цианобактерии Археи

Открытие BioY, транспортера биотина Исследование обобщенного BirA-регулона имеет консервативные сайты связывания BirA во всех исследованных геномах не имеет гомологов с известной функцией в белках семейства BioY обнаружено шесть потенциальных трансмембранных сегментов bioY – новый член обобщенного BirA-регулона

Открытие BioY, транспортера биотина Дополнительные соображения Хромосомные кластеры 1. cbiO-cbiQ – предполагаемые компоненты ABC-транспортной системы ( Указывает на то, что BioY может выполнять транспортную функцию ) 2. Гены биосинтеза жирных кислот. ( Биотин является кофактором карбоксилаз, ферментов данного метаболического пути ) 3. birA. гены располагаются в одном опероне или просто рядом на хромосоме такое расположение сохраняестя в различных геномах bioY кластеризуется с :

Цинк-зависимая регуляция паралогов рибосомных белков Паралоги рибосомных белков L36, L33, L31, S14 – единственные рибосомные белки, дуплицированные более, чем в одном геноме L36, L33, L31, S14 – четыре из семи рибосомных белков, содержащих мотив цинковой ленты: четыре эволюционно консервативных цистеина (в некоторых случаях один из них может быть заменен на гистидин) одна В случае наличия нескольких паралогов, одна из копий L36, L33, L31, S14 содержит мотив цинковой ленты, тогда как другие – нет Makarova K.S., Ponomarev V.A., Koonin E.V. (2001)Two C or not two C: recurrent disruption of Zn-ribbons, gene duplication, lineage-specific gene loss, and horizontal gene transfer in evolution of bacterial ribosomal proteins. Genome Biology. 2 (9). RESEARCH 0033.

Цинк-зависимая регуляция паралогов рибосомных белков Паралоги рибосомных белков Makarova K.S., Ponomarev V.A., Koonin E.V. (2001)Two C or not two C: recurrent disruption of Zn-ribbons, gene duplication, lineage-specific gene loss, and horizontal gene transfer in evolution of bacterial ribosomal proteins. Genome Biology. 2 (9). RESEARCH 0033.

Panina E.M., Mironov A.A., Gelfand M.S. (2003) Comparative genomics of bacterial zinc regulons: enhanced ion transport, pathogenesis, and rearrangement of ribosomal proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17) Цинк-зависимая регуляция паралогов рибосомных белков Исследование цинк-зависимой регуляции:

Цинк-зависимая регуляция паралогов рибосомных белков Обнаружены паралоги рибосомных белков в других геномах (выделены жирным) Найдены потенциальные сайты связывания регуляторов метаболизма цинка перед паралогами, не имеющими цинковой ленты.

Цинк-зависимая регуляция паралогов рибосомных белков Зачем Zn-зависимым регуляторам контролировать синтез рибосомных белков ? Гипотеза Известно, что Zn является необходимым компонентом ряда ферментов Достаточно Zn Недостаток Zn Рибосомные белки Ферменты В случае недостатка Zn часть в рибосому включаются белки, не содержацие цинка: рибосома «отдает» часть цинка ферментам

Цинк-зависимая регуляция паралогов рибосомных белков Гипотеза Достаточно Zn Недостаток Zn Рибосомные белки Ферменты L31 Экспериментальное подтверждение для L31 Bacillus subtilis Nanamiya H., Akanuma G., Natori Y., Murayama R., Kosono S., Kudo T., Kobayashi K., Ogasawara N., Park S.M., Ochi K., Kawamura F. (2004) Zinc is a key factor in controlling alternation of two types of L31 protein in the Bacillus subtilis ribosome. Mol. Microbiol. 52 (1)

Биосинтез лейцина в дрожжах Начинается в митохондрии, заканчивается в цитоплазме Транспортер промежуточного продукта, изопропилмалата, не известен Кандидат: YOR271cp Локализован в митохондрии Предсказаны 4 трансмембранных сегмента Имеется консервативный сайт связывания лейцинового регулятора Leu3p Регуляторная область YOR271c связывает Leu3p в ChIP-chip эксперименте Гомологичен транспортеру трикарбоксилатов крысы (хотя чувствительность и специфичность эксперимента ~50%, других кандидатов с консервативными сайтами нет)

Однажды Гегель ненароком И, вероятно, наугад Назвал историка пророком, Предсказывающим назад Изучение эволюции регуляции Б. Пастернак Историк - это вспять обращенный пророк Г. Гегель Предсказание новых членов регулона способствует пониманию устройства прокариотической клетки Изучение эволюции регуляторных систем

Регуляция биосинтеза NAD Экспериментальные данные Escherichia coli и Salmonella spp. Структура белка NadR : ДНК-связывающий никотинамид-нуклеотидаденилтрансферазный рибозилникотинамидкиназный NadR-регулон :

Регуляция биосинтеза NAD Данные сравнительной геномики Отсутствует ДНК-связывающий домен Enterobacteriales Pasteurellales

Регуляция биосинтеза NAD Данные сравнительной геномики Исчезновение регулона Enterobacteriales Pasteurellales

Регуляция биосинтеза NAD Данные сравнительной геномики Enterobacteriales Ген nadA регулируется у всех предствителей порядка Enterobacteriales

Регуляция биосинтеза NAD Данные сравнительной геномики Гены nadB и pncB регулируются у близких родственников E. coli а также у S. marcescens Enterobacteriales

Регуляция биосинтеза NAD Данные сравнительной геномики Enterobacteriales Авторегуляция nadR обнаружена у ряда организмов, формирующих отдельную ветвь на филогенетическом дереве

Регуляция биосинтеза NAD Модель эволюции I. Появление нового регулятора 1. Pasteurellales – регулон отсутствует, иногда белок не имеет ДНК- связывающего домена 2. Enterobacteriales – белок используется в качестве фактора транскрипции a) Регуляция гена nadA b 1 ) Регуляция генов nadB и pn c B b 2 ) Авторегуляция гена nadR Регуляторные взаимодействия могут менятся даже в близкородственных геномах и даже в случае регуляции важных метаболических путей Gerasimova A.V., Gelfand M.S. (2005) Evolution of the NadR regulon in Enterobacteriaceae. J. Bioinform. Comput. Biol. 3(4)

Эволюция FruR-регулона Экспериментальные данные FruR (Cra) Escherichia coli K-12 Фактор транскрипции, относится к LacI-семейству Связывается с ДНК в отсутствии лигандов, в присутствии лигандов диссоциирует от ДНК Может являться как репрессором, так и активатором Координирует потоки метаболизма углеводов активация транскрипции репрессия транскрипции лиганды

Эволюция FruR-регулона Предсказанная регуляция Enterobacteriales Pasteurellales Vibrionales Pseudomonadales исследован 21 геном из 4х порядков предсказана регуляция 7 оперонов активация транскрипции репрессия транскрипции Экспериментальные данные предсказанная регуляция Предсказан регуляторный каскад

Эволюция FruR-регулона Модель эволюции регуляция оперона fruBKA сохраняется в большинстве геномов FruR – изначально регулятор единственного оперона fruBKA

Эволюция FruR-регулона Модель эволюции Регулон отсутствует Pasteurellales : в ряде геномов не найдено ортологов для FruR в других геномах отсутствуют консервативные сайты перед предполагаемыми членами регулона FruR – изначально регулятор единственного оперона fruBKA

Эволюция FruR-регулона Модель эволюции Регулон отсутствует Enterobacteriales : FruR регулирует гены фосфотрансферазных систем, гликолиза/глюконеогенеза, цикла Кребса, NADH-дегидрогеназы, а также глобального регулятора CRP FruR – изначально регулятор единственного оперона fruBKA Расширение регулона, FruR – глобальный регулятор

Эволюция FruR-регулона Модель эволюции Регулон отсутствует Escherichia coli и Salmonella spp. : FruR – изначально регулятор единственного оперона fruBKA Расширение регулона, FruR – глобальный регулятор FruR также регулирует опероны mtlADR, fbp, pckA и aceBAK Дальнейшее расширение регулона

Новые тенденции в сравнительной геномике 1. Исследование нескольких функционально связанных регуляторных систем Восстановление оксидов азота в различных группах бактерий Rodionov D.A., Dubchak I.L., Arkin A.P., Alm E.J., Gelfand M.S. (2005) Dissimilatory metabolism of nitrogen oxides in bacteria: comparative reconstruction of transcriptional networks. PLoS Comput. Biol. 1. e55. Ravcheev D.A., Gerasimova A.V., Mironov A.A, Gelfand M.S. Complex comparative genomic analysis of respiration regulation in gamma-proteobacteria. Genome Biol. [in press] 2. Изучение таксон-специфической регуляции Сравнение геномов организмов, относящихся к одной таксономической группе Развитию методики способствует увеличение количества полных геномных последовательностей

Изучение таксон-специфической регуляции Enterobacteriales базовый геном Pasteurellales Классическая методика

Изучение таксон-специфической регуляции Классическая методика Enterobacteriales базовый геном Pasteurellales Проведена стандартная процедура проверки соответствия Таксон-специфичная регуляция

Изучение таксон-специфической регуляции Классическая методика - недостатки Enterobacteriales базовый геном Pasteurellales Ни в базовом геноме, ни в геномах родственных видов не найдено сайтов Потеря данных о таксон- специфичной регуляции

Изучение таксон-специфической регуляции Модифицированная методика Базовый геном не рассматривается В центре внимания – геномы организмов из исследуемого таксона Pasteurellales Поиск сайтов во всех геномах Попарное сравнение Ген регулируетсяГен НЕ регулируется P. multocida A.actinomycetemcomitans H. influenzae H. ducreyi

Экспериментальные данные Escherichia coli Стимул Сенсор Регулятор Анаэробные условияНитрат / Нитрит Регуляция транскрипции

Данные сравительной геномики Yersinia spp., Pasteurellales, Vibrionales Стимул Сенсор Регулятор Анаэробные условияНитрат / Нитрит Регуляция транскрипции Нитрат-нитритное дыхание регулируется лишь одной регуляторной системой

Исследованные геномы Enterobacteriaceae Pasteurellaceae Vibrionaceae Попарное сравнение всех геномов из одного таксона трех Исследование сразу трех регуляторных систем : Fnr ArcA NarP

Регуляторные каскады Escherichia coli - репрессия - активация - предсказанная активация экспериментальные данные - амбивалентная регуляция Fnr – главный регулятор, контролирующий экспрессию генов других регуляторов Сложная система регуляторных каскадов для регуляторов нитрат-нитритного дыхания

Регуляторные каскады Yersinia spp. Fnr – главный регулятор NarP не участвует в регуляторных каскадах Редукция NarP регулона

Регуляторные каскады Vibrionales Fnr – главный регулятор Увеличение роли ArcA в регуляторных каскадах Увеличение ArcA регулона

Регуляторные каскады Pasteurellales Снижение роли Fnr в регуляторных каскадах Увеличение роли ArcA и NarP в регуляторных каскадах Увеличение NarP регулона Существенные изменения в иерархии регуляторов

Выводы 1.В ходе эволюции регуляторные взаимодействия могут существенно изменяться 2.Данные изменения носят таксон-специфичный характер 3.Изменения в структуре регуляторных каскадов коррелируют с изменениями в структуре регулонов

Благодарности Гельфанд М.С. Миронов А.А. Рахманинова А.Б Герасимова А.В. Родионов Д.А. Панина Е.М. Закирзянова В. Спасибо за внимание !