1 Современное состояние и перспективы оптической микроскопии ближнего поля А.Н. Петрухин Институт химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук

2 Принцип Распространяющаяся световая волна Затухающее БЛИЖНЕЕ ПОЛЕ Идея: E.H. Synge, 1928 E.H. Synge, 1928 Экспериментальная реализация: A. Lewis, 1984, /16 A. Lewis, 1984, /16 D.W. Pohl, 1984, /20 D.W. Pohl, 1984, /20

3 Методы микроскопии ближнего поля АпертурныйБезапертурный

4 Апертурный микроскоп ближнего поля. Единичная молекула. N. HOSAKA, T. SAIKI, Journal of Microscopy, Vol. 202, Pt 2, May 2001, pp

5 Единичные молекулы на поверхности клеточной мембраны. M. Koopman et al. FEBS Letters 573 (2004) 6-10

6 Желтый флюоресцирующий белок zFP538 Zubova N.N., Korolenko V.A., Astafyev A.A., Petrukhin A.N., Vinokurov L.M.,Sarkisov O.M., Savitsky A.P. Brightness of Yellow Fluorescent Protein from Coral (zFP538) Depends on Aggregation. Biochemistry, 2005 Mar 15; 44 (10) : zFP538 – представитель класса флюоресцирующих белков высокая степень аггрегации бочонок 4.2 х 2.4 нм Water solution (ex at 480 nm) Solid Наши работы -- белок

7 м м м м нм Оптическая микроскопия ближнего поля 1. Топография 2. Пропускание 420 нм Апертурный микроскоп. Одиночная липофусциновая гранула из клеток эпителия глаза человека.

8 Апертурный микроскоп. Спектры флюоресценции в различных точках липофусциновой гранулы. Топография одиночной липофусциновой гранулы Спектры флюоресценции в точках 1-6

9 Апертурный зонд теоретический предел оптического разрешения 13 нм, на практике нм разрешение в топографии нм разрушение мягких образцов быстрый износ зонда флуоресценция материала волокна сложность изготовления + Достоинства: – Недостатки: облучается только малый объем возможность сбора излучения через зонд

10 Безапертурный зонд Высокое отношение ФОН / ПОЛЕЗНЫЙ СИГНАЛ + Достоинства: – Недостатки: Оптическое разрешение ограничено только радиусом закругления иглы высокое пространственное разрешение ! Решение проблемы: Двухфотонное возбуждение, зависимость сигнала от расстояния, комбинация апертурной и безапертурной методик

11 Двухфотонное возбуждение J-аггрегатов A. Bouhelier et al. Ultramicroscopy 100, 2004, Топография Флюоресценция Оптическое разрешение 25 нм 1 мкм

12 Одиночные молекулы Cy-3 в ДНК Оптическое разрешение 10 нм H.G.Frey, S. Witt, K. Felderberg, R. Guckenberger, Phys.Rev.Lett., 2004, 93, nm 200 nm

13 Анализ колебаний одностеночной углеродной нанотрубки Nanoscale vibrational analysis of single-walled carbon nanotubes Neil Anderson, Achim Hartschuh, Steve Cronin, and Lukas Novotny J. Am. Chem. Soc. 127, 2005, FWHM = 275 nm FWHM = 14 nm Ближнее полеКонфокальный Спектр рамановского рассеяния RBM G G D DGG

14 Схема установки из статьи или наш план? Полученные результаты Выводы: разрешение по пространству и по времени Микроскопия ближнего поля с фемтосекундным пространственным разрешением

15 Микроскопия ближнего поля с фемтосекундным пространственным разрешением Пространственное разрешение 150 нм, временное 250 фс U. Keller et al. Review of scientific instruments, 70, 1999,

16 УСТАНОВКА Апертурная и безапертурная микроскопия ближнего поля Фемтосекундная спектроскопия флюоресцентная спектроскопия двухфотонная спектроскопия Рамановская спектроскопия конфокальная и двухфотонная микроскопия

17 Оптическое разрешение 10 нм. Имеются 3 работы, объединившие микроскопию ближнего поля и фемтосекудную спектроскопию. ВЫВОДЫ

18 Флюоресценция Двухфотонная флюоресценция Рамановское рассеяние Методы безапертурной микроскопии

19 Единичные молекулы GFP в фибропласте

20 Микроскопия ближнего поля с фемтосекундным пространственным разрешением Пространственное разрешение 200 нм, временное 200 фс