1 Методы ЛАЛ-теста Часть 3

2 Признанные методы ЛАЛ- теста Гель-тромб Полуколичественный гель-тромб Хромогенный Турбидиметрический Кинетический хромогенный Кинетический турбидиметрический

3 Какой метод лучше? У каждого метода есть свои преимущества Выбор метода зависит от: –Требуемого результата количественный полуколичественный –Имеющегося в наличии оборудования –Типа образца

4 Выбор метода У каждого метода свое назначение Для выбора метода необходимо оценить тип и объемы тестирования В некоторых случаях имеет смысл применять более одного метода, например, для тестирования воды – кинетический хромогенный и кинетический турбидиметрический

5 Механизм реакции Образование геля и турбидиметриче ский тип ИЛИ Хромогенный тип

6 Гель-тромб метод Механизм и суть метода

7 Лизат амебоцитов Limulus Гель-тромб метод Профермент Активный фермент Эндотоксин Коагулянт Свертывающийся белок + (фрагмент) Активный фермент Свертывающийся белок Образование геля Электростатические связи

8 Постановка гель-тромб теста Шаг за шагом

9 Подготовка образцов и правильное разведение, дозирование в пробирки

10 Приготовьте стандарт или серии стандартов и дозируйте в пробирки

11 Добавьте положительные контроли

12 Восстановите ЛАЛ-реактив ЛАЛ- реагентной водой

13 Добавьте лизат в пробирки для постановки реакции

14 Поместите в инкубатор на 60 минут

15 Медленно переверните пробирку Гель-тромб (Положительный)

16 Интерпретация результатов гель- тромб теста Очень простой тест Результат интерпретируется субъективно Следовательно, результат зависит от лаборанта Метод считается недорогим, однако все зависит от количества образцов Наиболее доступный метод по начальным инвестициям

17 Возможные проблемы гель- тромб метода Результаты считываются на-глаз после переворачивания пробирки вручную На образование геля влияют различные факторы вибрация pH температура другие белки Трудоемкий метод для средних и больших партий Трудоемкий для валидации продукта метод

18 Заявленная чувствительность лизата=0.125 ЕЭ/мл Допуск 0.25 ЕЭ/мл до 0.06 ЕЭ/мл Образец Ср. геометрическое =Antilog ( 1 x Log (0.125) + 3 x Log (0.062)) /4 + + Пример гель-тромб метода для подтверждения заявленной чувствительности лизата

19 Виды гель-тромб метода Два вида гель-тромб метода –предел –Полуколичественный Предел –Дает ответ ДА/НЕТ при определенной чувствительности реактива Полуколичественный –Можно определить концентрацию эндотоксина в образце путем серии разведений

20 Методы конечной точки Механизм и суть метода

21 Методы конечной точки Теоретически существует два метода –Хромогенный метод конечной точки –Турбидиметрический метод конечной точки На практике применяется только хромогенный метод конечной точки

22 Хромогенный метод конечной точки Первый разработанный количественный метод Диапазон чувствительности зависит от времени инкубирования –Типичный диапазон:1.0 ЕЭ/мл до 0.1 ЕЭ/мл –Расширенный диапазон:0.1 ЕЭ/мл до 0.01 ЕЭ/мл Линейная зависимость от уровня эндотоксинов Пониженная чувствительность к интерферентным факторам благодаря применению хромогенного субстрата

23 Замещение хромогенным субстратом коагулянта

24 Постановка хромогенного теста конечной точки Шаг за шагом

25 Дозируйте стандарт и образец

26 Добавьте 50 л лизата и инкубируйте

27 Добавьте 100 л субстрата и инкубируйте

28 Добавьте 100 л реактива для остановки реакции

29 Результаты считываются через 405 нм фильтр

30 Характеристики хромогенного метода конечной точки Требует многоразового добавления реактивов –Добавить лизат в стандарт и образец и инкубировать –Добавить субстрат и инкубировать –Добавить реактив для остановки реакции (10% уксусная кислота или 10% SDS) –Считывание результатов на волне 405 нм Соответствие температуры инкубации (37 o C) является критичным фактором

31 ЛАЛ тест хромогенный конечной точки Профермент Активный фермент Эндотоксин Хромогенный субстрат Высвобождение PNA + (фрагмент) Активный фермент Концентрация PNA (Желтый цвет) Концентрации эндотоксина Прямая зависимость от

32 Хромогенный тест конечной точки Коэффициент корреляции (R 2 ) = OD Linear (OD )

33 Оценка хромогенного теста конечной точки Дает количественный результат, интерпретация результатов объективная, результаты стабильны в течение 30 мин Хромогенный субстрат снижает влияние интерферентных факторов Трудоемкий процесс, в ходе которого возможны ошибки оператора Процесс можно автоматизировать

34 Возможные проблемы хромогенного метода конечной точки Короткое время инкубирования обусловливает сложность поддержания равномерности поддержания температуры микропланшет Узкий диапазон может требовать дополнительных разведений для получения результатов Трудоемкий метод Реагент для остановки реакции может вызвать выпадение осадка

35 Кинетические методы Механизм и суть методов

36 Кинетические методы Наиболее недавние методы Наиболее объективные методы Два вида кинетических методов –Кинетический турбидиметрический –Кинетический хромогенный

37 Кинетический турбидиметрический метод Первый из разработанных кинетических методов Широкий стандартный диапазон – ЕЭ/мл Первые методики были неточными на всем диапазоне измерений Современные реактивы дают меньшую погрешность

38 Кинетический турбидиметрический метод Добавление реактива только один раз –Добавить реактив в стандарт –Добавить положительные контроли продукта (обычно по 10 л) –Подогрейте планшет –Добавьте лизат и начните тест –Определите результаты Микропланшеты также требуют обработки в шейкере

39 Кинетический турбидиметрический ЛАЛ-метод Профермент Активный фермент Эндотоксин Коагулянт Свертывающийся белок + (фрагмент) Активный фермент Свертывающийся белок Образование мутности Электростатические связи

40 Кинетический турбидиметрический метод Более быстрый метод, чем количественный конечной точки Широкий диапазон Очень хорошо подходит для тестирования воды, но могут быть сложности с концентрированными сложными продуктами Менее дорогостоящие реагенты, чем для кинетического хромогенного метода Менее стабильный в процессе исполнения метод, чем кинетический хромогенный метод

41 Кинетический турбидиметрический метод – возможные трудности Слабое отношение сигнал-шум, наличие пузырьков могут затруднять анализ Влияние таких же интерферентных факторов как и для гель-тромб теста: вибрация pH температура другие белки Наличие пузырьков может затруднить анализ Не подходит для вязких и мутных продуктов

42 Кинетический хромогенный метод Наиболее поздний из кинетических методов вследствие трудности создания комбинированного реактива –Лизат и синтетический субстрат Отличное отношение сигнал-шум по сравнению с турбидиметрическим методом –Кинетический хромогенный - Delta OD 200 milliOD –Кинетический турбидиметрический - Delta OD 30 milliOD Менее подвержен влиянию интерферентных факторов

43 Кинетический хромогенный метод Широкий стандартный диапазон –До 4 log диапазона ( ЕЭ/мл) Реактив добавляется один раз, что минимизирует вероятность ошибки оператора Применение синтетического субстрата облегчает валидацию комплексных продуктов Позволяет анализировать мутные и вязкие образцы

44 Проведение кинетического хромогенного метода Шаг за шагом

45 Дозируйте стандарты и образцы

46 Добавьте положительный контроль продукта (ПКП) Pre-warm the Plate in the incubating reader for 10 minutes

47 Добавьте лизат и начните анализ

48 Планшет инкубируется, показания считываются каждые 150 секунд

49 Готовый анализ Примечание: KQCL легко справляется с сильно окрашенными образцами, например, метиленовый синий

50 Кинетический хромогенный метод Реагент добавляется только один раз –Дозируйте стандарты и образцы –Добавьте положительный контроль продукта (как правило по 10 л) –Подогрейте планшет –Добавьте лизат и начните анализ –Collect Results Микропланшеты также требуют обработки в шейкере

51 Кинетический хромогенный метод ЛАЛ Профермент Активный фермент Эндотоксин Хромогенный субстрат Высвобождение PNA + (фрагмент) Активный фермент Концентрация PNA (желтый цвет) Концентрация Эндотоксина Прямо пропорциональна

52 Суть кинетического хромогенного метода В начале теста считывается оптическая плотность Результаты первого считывания принимаются за базовую линию – цвет, прозрачность, др. Прибор измеряет оптическую плотность через фиксированные промежутки времени и определяет изменение оптической плотности на OD 30 для кинетического турбидиметрического и OD 200 для кинетического хромогенного метода Анализ считается завершенным когда достигается нижняя стандартная точка

53 Кинетическая ЛАЛ реакция

54 Кинетическая хромогенная реакция Время затраченное на достижение точки 200 mOD зависит от концентрации эндотоксина Для создания стандартной кривой используется стандарт Т.к. результаты теста носят нелинейный характер, для создания стандартной кривой необходимо производить log-log преобразования

55 Slope = Y-Int = R = Зависимость времени реакции от концентрации эндотоксина

56 Кинетические методы Нестандартная кинетика ферментов дает нелинейные результаты Первоначальные методы не принимали в расчет данную особенность Новые методы вносят соответствующие коррективы

57 Кинетика реакции Классическая кинетика Michaelis Menton –При определенных условиях скорость ферментной реакции линейно зависит от исходной концентрации фермента –Изменение абсорбции в течение времени находится в линейной зависимости от концентрации эндотоксина

58 Кинетика реакции Но не все ферментные реакции носят линейный характер Кинетические ЛАЛ методы: –В начале анализа отсутствует активный фермент –Фермент образуется в результате присутствия эндотоксина и его реакции на первой стадии каскадной реакции

59 Что измеряется? Реальные измерения учитывают время задержки до появления фермента Зависимость этой задержки или времени реакции и концентрацией эндотоксина нелинейная

60 Reaction Times vs Endotoxin Concentrations Типичные данные кинетического ЛАЛ анализа (линейный вид)

61 Линейные кинетические результаты Такие данные не могут применяться для анализа неизвестных, в особенности с применением линейной регрессии Как можно линеаризировать данные? По предыдущим данным можно сократить диапазон

62 Reaction Times vs Endotoxin Concentrations Кинетический ЛАЛ-анализ

63 Кинетические данные Сокращение диапазона не улучшает форму кривой Шаг 1: Log ось эндотоксина –Расширение интервала малых значений –Сокращение интервала высоких значений

64 Reaction Times vs Endotoxin Concentrations Кинетический ЛАЛ - 1 Log

65 Кинетические результаты Одноразовое логарифмирование недостаточно для улучшения стандартной кривой Следующий шаг: –Log ось времени (ось Y) По-новому нанесите кривую

66 Кинетический ЛАЛ, Log-Log преобразование Reaction Times vs Endotoxin Concentrations

67 Кинетические результаты Практически линейные Но не совсем –На примере видно корреляционный коэффициент –Тем не менее, наблюдается отклонение –Это может привести к неточностям при определении неизвестных

68 Линейная регрессия метод наименьших квадратов

69 Линейная регрессия – Восстановление исходных значений Method of Least Squares

70 Источник неточностей Самое большое отклонение зачастую находится в середине линии регрессии –В этой точке как правило проявляется положительный контроль Влияет на расчет ЕЭ для различных разведений одного образца

71 Альтернативные методы расчетов В идеале нужно придать кривой форму регрессионной линии Формула линейной регрессии –Y=A+BX Определения уравнения –Расширенный анализ включает 4 определения………..

72 PowercurveTM PowercurveTM is a patented controlled fit method which prevents wrapping –Y=A+B(X)+C(X2)+D(X3)E(X4)

73 Аппроксимация полиномной кривой Аппроксимация полиномной кривой широко применяется в клинических исследованиях В данном методе есть потенциальная проблема – если не достаточно жестко контролировать расчеты, то кривую можно «подогнать» под любые результаты!!

74 Неконтролируемая полиномная аппроксимация

75 Power кривая Линейная регрессия Сравнение показателей точности

76 Power Curve Power Curve признана контролирующими органами Улучшает точность результатов Сниженное количество повторений теста Устраняет проблему плавающих значений при разведении образца

77 Обзор методов Выбор метода зависит от: –Количества образцов –Типа образцов –Доступного оборудования или –Бюджет –Необходимость количественных результатов

78 …………… Как будут развиваться методики? Человеческий фактор будет присутствовать и в дальнейшем Данную проблему могут решить только роботы В 1998 BioWhittaker представил на рынок автоматический AutoLAL

79 AutoLAL Сочетание системы дозирования жидкостей Beckman Biomek и ридера Biotek и программного обеспечения BioWhittaker Автоматическое приготовление стандарта и образца Автоматическое дозирование образцов, стандартов и положительных контролей Автоматическое добавление лизата, инкубирование и чтение результатов

80 Преимущества AutoLAL Сниженное количество ручного труда Сниженное количество повторений Улучшенная воспроизводимость Отсутствие отклонений при Работе разных операторов