ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЕ СУБПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ CD4 ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ Модуль 7. Уровни CD4 как иммунологический клинический маркер для мониторинга ВИЧ-инфекции

Задачи В конце данного модуля вы сможете: дать определение CD4 и роли клеток CD4 в работе иммунной системы; описать практическую значимость подсчета количества клеток CD4 для планирования и мониторинга процесса лечения.

Задачи В конце данного модуля вы сможете: описать влияние антиретровирусной терапии на мониторинг; оценить, имеются ли соответствующие данные для определения референс-диапазона для взрослых и детей в вашей региональной популяции.

Программа на сегодня Иммунная система – Гемопоэз – Субпопуляции лимфоцитов – Общие CD-маркеры и CD4 CD4 и ВИЧ-инфекция Референс-диапазоны CD4 Научные исследования Резюме

Введение в иммунную систему Защита организма: два уровня Врожденный иммунитет – Неспецифический – Первая линия защиты – Воспаление – Повторное воздействие без нарастания

Введение в иммунную систему Защита организма: два уровня Приобретенный иммунитет – Специфический – Вторая линия защиты – Повторное воздействие нарастание память

Врожденный иммунитет Реснитчатый эпителий: трахея Лизоцимы Слизь Сальные железы Кожа Кислота в желудке Симбионтные микроорганизмы в кишечнике и влагалище Спермин в семенной жидкости Компоненты – Биохимические Ферменты, комплемент и т. п. Секреция pH – Физические Кожа Реснитчатый эпителий – Клетки Фагоциты, естественные киллеры (NK)

Взаимодействие приобретенного и врожденного иммунитета Инфекционное воздействие Врожденный иммунитет предотвращает Врожденный иммунитет не срабатывает Система приобретенного иммунитета Выздоровление Второе инфекционное воздействие тот же микроорганизм Приобретенный иммунитет Специфическая память Отсутствие заболевания Заболевание

Система врожденного иммунитета Компоненты – Биохимические Ферменты, комплемент и т. п. Секреция pH – Физические Кожа Реснитчатый эпителий – Клетки Фагоциты, естественные киллеры (NK)

Приобретенный/антиген- специфический иммунитет Гуморальный иммунитет – Опосредованный антителами (белками), которые атакуют чужеродные вещества. Клеточный иммунитет – Опосредованный клетками (Т-лимфоцитами), которые напрямую атакуют чужеродные вещества.

Лимфоциты Эти клетки происходят из клетки- предшественницы в костном мозге. Дифференцировка и созревание происходит в костном мозге (B-клетки) и вилочковой железе (T-клетки). В процессе созревания они начинают экспрессировать рецепторы антигенов и становятся способными реагировать на антигенную стимуляцию.

Развитие лимфоцитов На данной схеме показаны различные типы клеток крови. T-клетки являются субпопуляцией лимфоцитов, развивающейся в вилочковой железе. Клетки T-хелперы являются субпопуляцией T-лимфоцитов. Общий предшественник лимфоцитов Плюрипотентная стволовая клетка Миелоидный предшественник Предшественник T-клетки Предшественник B-клетки Мегакариоцит Эритробласт Нейтрофил Эозинофил Эритроцит БазофилМоноцит Тромбоциты B-клетка Естественный киллер (NK-клетка) Вилочковая железа (тимус) Естественный киллер (NK-клетка) B-клеткаT-клетка Моноцит Базофил Макрофаг Тучная клетка Ткани T-зависимые зоны лимфатических узлов и селезенки B-клеточные зоны лимфатических узлов, селезенки, пейеровых бляшек и миндалин

B-лимфоциты Эти клетки являются производными стволовых клеток и созревают в костном мозге. B-клетки продуцируют антитела. Антитела (иммуноглобулины) могут секретироваться B-клеткой или оставаться связанными с поверхностью В-клетки.

T-лимфоциты Предшественники зарождаются в костном мозге, мигрируют в вилочковую железу и созревают в ней. В дальнейшем они подразделяются: – на клетки T-хелперы; – цитотоксические T-клетки. Рецептор антигена на T-лимфоцитах является рецептором T-клетки (TcR), по структуре родственным антителам.

Клетки T-хелперы Секретируют низкомолекулярные белки (цитокины) в ответ на антигенную стимуляцию. Эти цитокины являются сигналом для Т-клеток, В-клеток и макрофагов к началу или к поддержанию иммунного ответа. Иммунный ответ направлен на противоборство с инфекционным микроорганизмом и его уничтожение.

Взаимодействие T- и B-клеток

CD4 на клетках T-хелперах Клетки T-хелперы имеют на своей поверхности белок, называемый CD4. Белок gp120 на поверхности ВИЧ связывается с этим белком CD4, таким образом происходит инфицирование T-хелперов.

CD4 на клетках T-хелперах При повышении степени тяжести ВИЧ-инфекции количество клеток, экспрессирующих CD4, будет падать. Таким образом, знание количества клеток CD4 у ВИЧ-инфицированного лица позволяет оценить степень тяжести заболевания.

Прикрепление gp120 на ВИЧ к CD4 и рецептору хемокина на клетке Т-хелпере Глико- протеин gp120

Цитотоксические T-клетки Субпопуляция Т-клеток. Эти клетки способны разрушать клетку- мишень, содержащую инфекционный микроорганизм, например вирус. Цитотоксические T-клетки имеют на своей поверхности белок, называемый CD8.

Цитотоксичность CD8 T-клетки

Как различить лимфоциты Лимфоциты несут на своей поверхности белки, связанные с функцией клетки. – Например, CD4 на клетках T-хелперах или CD8 на цитотоксических T-клетках. В лабораторных условиях можно идентифицировать эти белки и таким образом определить количество лимфоцитов каждого типа. Термином CD обозначается унифицированная номенклатура, принятая для идентификации этих белков.

Что означает CD? CD означает «кластер дифференцировки», относящийся к белкам поверхности клетки. Эти белки часто связаны с клеточной функцией; клетки с различными функциями экспрессируют различные молекулы CD. Описано более 300 молекул CD.

CD4 Белок CD4 обнаруживается на поверхности клеток различных типов, включая клетки T-хелперы. Этот белок также связывается с молекулой gp120, которая экспрессируется на внешней поверхности ВИЧ. – Это связывание является первым контактом между ВИЧ и его клеткой-мишенью. – Для ВИЧ-инфицирования клетки также необходимы другие молекулы, известные как рецепторы хемокинов.

Прикрепление gp120 на ВИЧ к CD4 и рецептору хемокина на клетке Т-хелпере Глико- протеин gp120

Молекулы СD, используемые для идентификации различных подклассов лимфоцитов CD45Все лейкоциты CD3T-клетки CD4Клетки T-хелперы CD8Цитотоксические T-клетки CD19B-клетки CD56Клетки естественные киллеры (NK)

Вопросы?

Программа на сегодня Иммунная система – Гемопоэз – Подклассы лимфоцитов – Общие CD-маркеры и CD4 CD4 и ВИЧ-инфекция Референс-диапазоны CD4 Научные исследования Резюме

Связывание ВИЧ с CD4 и рецептором хемокина

CD4 на клетках T-хелперах Клетки T-хелперы необходимы для надлежащего функционирования системы приобретенного (антиген-специфичного) иммунитета. ВИЧ угнетает иммунный ответ, инфицируя и разрушая CD4-положительные клетки T-хелперы. – Таким образом, количество CD4-положительных T-клеток в периферической крови позволяет оценить степень иммуносупрессии, вызванной ВИЧ.

Показатель количества клеток CD4 не является основанием для диагноза ВИЧ-инфекции. Количество СD4-положительных T-клеток может снижаться и при других вирусных инфекциях или состояниях иммунодефицита, не связанных с ВИЧ. Показатель количества CD4-положительных T-клеток может быть использован для оценки стадии заболевания или для мониторинга снижения иммунитета у лиц с ВИЧ-инфекцией, подтвержденной исследованиями по определению антител, антигена и (или) нуклеиновых кислот.

Клиническая значимость мониторинга клеток CD4 Центры по контролю за заболеваниями США и ВОЗ включают определение уровня CD4-положительных T-клеток в оценку стадии ВИЧ-инфекции. Определение количества CD4-положительных T-клеток используется также при начале АРТ и лечении связанных с ВИЧ заболеваний. – Показатель количества CD4 T-клеток может быть использован как индикатор эффективности антиретровирусной терапии.

Клиническая значимость мониторинга клеток CD4 Абсолютное количество CD4-положительных T-клеток выражается в клетках на микролитр (клеток/мкл). – Врачи также используют данные о доле T-лимфоцитов, экспрессирующих CD4, особенно в детской популяции ВИЧ-инфицированных.

Запомните Несмотря на то что показатель количества CD4-положительных T-клеток является критическим инструментом мониторинга ВИЧ-инфекции, снижение количества CD4-положительных T-клеток само по себе не является диагностическим показателем наличия ВИЧ-инфекции.

Запомните Основными методами лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции являются серологические, вестерн-блот анализы и обнаружение ДНК/РНК. Существуют другие состояния первичного иммунодефицита, приводящие к пониженным значениям количества клеток Т-хелперов. При этих состояниях не наблюдается прогрессирующее во времени снижение количества клеток CD4, как это имеет место при ВИЧ-инфекции.

CD4 T-клетки и ВИЧ Снижение количества CD4-положительных T-клеток связано с повышенным риском развития оппортунистических инфекций и прогрессирования ВИЧ-инфекции. – Снижение количества клеток СD4 до менее 200/мкл сопровождается более высоким риском развития пневмоцистозов. – Значения CD4 менее 100/мкл ассоциируются с более высоким риском развития микобактериальных инфекций. Показатель количества CD4-положительных T-клеток используется для клинического прогнозирования, мониторинга ответа на лечение в качестве критерия включения в антиретровирусную терапию.

Динамика снижения количества CD4-положительных T-клеток ВИЧ-инфекция развивается в СПИД у различных пациентов с разной скоростью. Динамика снижения количества CD4-положительных T-клеток может быть использована в качестве вспомогательного показателя при мониторинге пациентов для определения, являются ли они «быстро прогрессирующими», «длительно непрогрессирующими» или «обычными непрогрессирующими».

Клинические последствия ВИЧ- инфекции (быстро прогрессирующие) 26 недель В среднем 5 лет между инфицированием и диагнозом СПИД Бессимптомная фаза Гриппо- подобное заболевание (характерно не для всех пациентов) Фаза с наличием симптомов СПИД CD4 T-клеток/мкл Инфекция Сероконверсия Смерть Снижение количества CD4 T-клеток Высокоактивная антиретровирусная терапия (HAART)

Клинические последствия ВИЧ- инфекции (медленно прогрессирующие) 26 недельВ среднем 20 лет Бессимптомная фаза Гриппо- подобное заболевание (характерно не для всех пациентов) СФ Инфекция Сероконверсия Снижение количества CD4 T-клеток СПИДСПИД Смерть Высокоактивная антиретровирусная терапия (HAART) CD4 T-клеток/мкл

Вопросы?

Программа на сегодня CD4 – Определение – Подклассы лимфоцитов – Гемопоэз CD4 и ВИЧ-инфекция Референс-диапазоны CD4 Научные исследования Резюме

Изменение лимфоцитарного состава крови с возрастом У новорожденных и детей раннего возраста абсолютное количество лимфоцитов, а также абсолютное количество CD4-положительных T-клеток выше, чем у взрослых. В целом абсолютное количество лимфоцитов каждого подкласса снижается с возрастом.

В противоположность абсолютным показателям процентное соотношение субпопуляций лимфоцитов и соотношение CD4:CD8 остаются практически постоянными для всех возрастных групп. Мировая практика свидетельствует, что при ведении пациентов детского возраста врачи используют показатели процентного содержания CD4- положительных T-клеток, а для взрослых пациентов измеряют абсолютное количество CD4 T-клеток. Изменение лимфоцитарного состава крови с возрастом

Референс-значения количества CD4 T-клеток Уровень CD4-положительных T-клеток наиболее широко используемый маркер при мониторинге иммунного статуса ВИЧ-инфицированных лиц. На показатель количества CD4-положительных T-клеток у лиц, серонегативных по ВИЧ, оказывают влияние возраст, расовая принадлежность, регион проживания, пол, время взятия пробы крови и физическая нагрузка.

Референс-значения количества CD4 T-клеток Предположительно, различие, наблюдаемое между разными популяциями, обусловлено как генетическими особенностями, так и факторами окружающей среды, хотя однозначные причины таких различий не выявлены. Такая изменчивость показателей указывает на необходимость установления или проверки в лабораторных условиях референс-диапазонов содержания подклассов лимфоцитов у местной популяции здоровых лиц.

Лаборатории, определяющие CD4- положительные T-клетки, должны определить соответствующие референс-диапазоны для популяций, которые они обслуживают. – Имеются публикации исследований референс- значений субпопуляций лимфоцитов в различных географических регионах. Референс-значения количества CD4 T-клеток

Определение референс- диапазонов СD4 Определение количества CD4-положительных T-клеток следует проводить в большой выборке здоровых лиц, репрезентативной по возрасту и полу относительно обслуживаемой популяции. Диапазон, включающий 95 % значений, определенных у здоровых лиц, будет являться референс-диапазоном для данной популяции.

Протокол определения референс-диапазонов показателя CD4 T-клеток у взрослых Исследуемая популяция – Нормальные здоровые взрослые доноры (1865 лет), не получающие лекарственной терапии по поводу клинически выраженного заболевания. – Если в вашем регионе реализуется программа донорства крови, для определения референс- диапазонов можно использовать образцы от здоровых доноров крови.

Протокол анализа – Референс-диапазон следует определять, используя тот же инструмент, который будет использоваться при проведении анализа у пациентов. – Определите референс-диапазоны для всех подклассов лимфоцитов, которые могут использоваться в реализуемой программе мониторинга ВИЧ. В некоторых регионах или некоторыми врачами при мониторинге пациентов также используется значение CD8. Протокол определения референс-диапазонов показателя CD4 T-клеток у взрослых

Определение референс- диапазонов СD4 у детей В определенной местности в связи с отсутствием возможности проведения анализа у достаточного количества здоровых детей установление референс-диапазонов для детей бывает невозможным. – В случае отсутствия возможности местного определения диапазонов в качестве руководства могут быть использованы опубликованные референс-диапазоны. Перечень публикаций приведен в приложении. – Опубликованные диапазоны должны быть проверены путем проведения анализа у небольшого количества местных добровольцев.

Суточные изменения содержания клеток CD4 Уровни СD4-положительных T-клеток (и общего количества лимфоцитов) имеют тенденцию к повышению в период бодрствования (08:0022:00). – Эти повышения могут достигать 60 CD4-положительных T-клеток/мкл у ВИЧ-инфицированных пациентов и сотен клеток/мкл у здоровых лиц контрольной группы. Таким образом, для минимизации влияния указанных суточных колебаний при мониторинге все образцы следует отбирать приблизительно в одно и то же время суток.

Вопросы?

Программа на сегодня CD4 – Определение – Подклассы лимфоцитов – Гемопоэз CD4 и ВИЧ-инфекция Референс-диапазоны CD4 Научные исследования Резюме

Практикум 1: разбор случая (пациент с ВИЧ-инфекцией) Значения показателя количества клеток СD4 у пациен- тов с ВИЧ-инфекцией измеряют периодически в целях мониторинга иммунного статуса пациента. Значение абсолютного количества клеток CD4 у ВИЧ-инфицированного пациента составляет 75/мкл по состоянию на 1 апреля. По состоянию на 1 июля абсолютное количество клеток CD4 составляет 110/мкл. Апрельский образец был взят в 09:00. Июльский образец был взят в 16:30. Вопрос. Следует ли рассматривать такой результат как значимое увеличение абсолютного количества клеток СD4? Будьте готовы объяснить ваш ответ.

Разбор практикума 1: разбор случая (пациент с ВИЧ-инфекцией) Вопрос. Следует ли рассматривать такой результат как значимое увеличение абсолютного количества клеток CD4? Ответ. Наблюдаемое различие не обязательно означает значимое увеличение абсолютного количества клеток CD4. Значения абсолютного количества клеток CD4 возрастают с 09:00 до 16:30. Следует повторно взять образец крови у пациента приблизительно в 09:00, чтобы сравнение было значимым.

Программа на сегодня CD4 – Определение – Подклассы лимфоцитов – Гемопоэз CD4 и ВИЧ-инфекция Референс-диапазоны CD4 Научные исследования Резюме

CD4 белок, экспрессируемый на поверхности клеток T-хелперов. CD4 является рецептором для ВИЧ. ВИЧ инфицирует и разрушает CD4 T-клетки.

Резюме Показатель количества CD4-положительных T-клеток используется в качестве суррогатного маркера снижения иммунитета у ВИЧ-инфицированных лиц. Низкое количество CD4-положительных T-клеток не является диагностическим признаком ВИЧ-инфекции.

Резюме Референс-диапазон для значения CD4-положительных T-клеток меняется в зависимости от возраста пациента, времени получения образца и региона проживания. Каждая лаборатория, выполняющая анализ клеток CD4, должна определить или валидировать соответствующий референс- диапазон для анализируемой популяции.

Благодарю за участие! Остались ли какие-то вопросы?