Лекция 9. МОДЕЛИРОВАНИЕ ГЕНОТИПА КЛЕТКИ ТРАНСФОРМАЦИЯ ОРГАНЕЛЛ Алло - и изоплазматические линии растений Соматические гибриды у растений и животных Генетическая трансформация клеточных органелл Биотехнологические задачи и трансформация пластома Внутриклеточное перераспределение генов Инвертированная генетика.

Все известные подходы к созданию ядерно-цитоплазматических химер можно условно разделить на три группы: Моделирование генотипа ядерно-цитоплазматических химер Моделирование на уровне организма Моделирование на уровне отдельных гибридных клеток и регенерантов, полученных из них Моделирование на уровне геномов органелл Транспластомные томаты

Моделирование на уровне организма Реципрокные гибриды реципрокные гибриды аллоплазматические линии изоплазматические линии а А В b ABAB a x b B A a ABAB b x А(а) х В(в) = АВ (а) В(в) х А(а) = АВ (в)

Как у растений, так и у животных яйцеклетка, несущая значительный запас различных биосинтетических компонентов (в том числе долгоживущих матричных РНК), может предопределять особенности развития организма. Этот материнский эффект обусловлен ядерными генами яйцеклетки, а не различием по органельным генам двух родителей Реципрокные гибриды являются не самой удачной моделью для изучения эффектов цитоплазматичесих генов, так как не всегда различия в фенотипе гибридов связаны с геномами органелл Семена прямых и обратных гибридов F1 однодольных различаются геномами своих триплоидных эндоспермов – ААВ и АВВ, соответственно Генетические различия между эндоспермами могут вызывать различия в развитии растений, особенно на ранних стадиях их онтогенеза

аллоплазматические линии а А В b ABAB a x B a В b x 6-10 поколений насыщающих скрещиваний изоплазматические линии а А В b ABAB a x B a В b x 6-10 поколений насыщающих скрещиваний Моделирование на уровне организма Межвидовые скрещивания Внутривидовые скрещивания

A(мт a хп a ) х B (мт b хп b )B(мт a хп a ) Геномы аллолиний Белки органелл аллолиний A(мт A хп A ) х B (мт B хп B ) B(мт B+A хп B+A ). IСхема наследования ДНК органеллами при создании аллолиний путем беккроссирования (при условии строго материнского наследования органелл). А – материнское растение, В – опылитель, В(А) – аллолиния, имеющая генотип ядра В (опылителя) и геномы органелл А (исходного материнского растения). I Белки органелл аллолиний кодируются как ядром В (линии-опылителя) (бóльшая часть), так и собственными геномами органелл А (не более 1% всех белков, входящих в состав органелл). многократное беккроссирование B мт хп х A хп мт B+A B А - белки пластид и митохондрий, кодируемые ДНК органелл В - белки пластид и митохондрий, кодируемые ДНК ядра Аллолиния В(А) B А A многократное беккроссирование мт хп х A хп мт B

Одна из самых больших в мире коллекций аллоплазматических линий создана на пшенице В 1951 году японский генетик Kихара создал первую серию аллоплазматических линий Triticum aestivum Aegilops ovata Донор ядра, мягкая пшеница Донор цитоплазмы, дикий злак Сейчас коллекция аллоплазматической пшеницы, созданной в Японии учениками и последователями Kihara, включает линии с ядерными генотипами 12 сортов гексаплоидной мягкой пшеницы и цитоплазматическими геномами 8 различных видов пшениц (10 источников) и 24 видов эгилопсов (36 источников) – всего 552 комбинации

Коллекция, сочетающая геномы 7 сортов культурного ячменя Hordeum vulgare и цитоплазматические геномы 12 форм дикого, полукультурного и культурного ячменя (H. vulgare и H. spontaneum) – всего 84 ядерно-плазменные комбинации, была создана в нашей лаборатории И.М.Голоенко под руководством О.Г.Давыденко Влияние генома органелл на процессы и свойства растений, изученные с помощью аллолиний экспрессия ядерных генов, контролирующих морфологические и количественные признаки фертильность фотосинтетические и респираторные параметры устойчивость к патогенам и другим стрессовым факторам морфогенетические потенции конъюгацию хромосом, трансмиссию и рекомбинацию отдельных компонентов ядерного генома

Моделирование на уровне клетки Гибридизация неполовых клеток растений – второй способ получения ядерно-цитоплазматических химер – впервые была выполнена в 1972 г. В последующее десятилетие это направление пережило настоящий бум: были опубликованы десятки работ, сообщавшие более чем о 70 экспериментах на различных видах Nicotiana Glycine Daucus Petunia Solanum Brassica Arabidopsis цибриды Чьи органеллы обнаруживаются у цибридов ?

S.tuberosum+ S.commersonii 8 растений с пластидами S. commersonii 6 растений с пластидами S. tuberosum + S. commersonii Не удалось обнаружить гибрид, сочетающий пластиды S. tuberosum и митохондрии S. commersonii N. tabacum + P. hybrida N. tabacum – ядро N. tabacum митохондрии P. hybrida- пластиды Цибрид жизнеспособный N. tabacum – ядро ~ " N. tabacum " митохондрии P. hybrida- пластиды Цибрид аномальный (митохондриальная ДНК рекомбинантная) Митохондрии P. hybrida несовместимы с ядром N.tabacum Сегрегация пластид у цибридов может происходить в пользу как одного, так и другого родителя Если пластиды одного вида чем-то повреждены

S.tuberosum + S.commersonii Все растения с пластидами S. commersonii растения с пластидами S. tuberosum + S. commersonii Гербицид SAN 9789 вызывает обесцвечивание пластид При повреждении пластид гербицидом цибриды гомопластидны

внутривидовые, межвидовые межродовые Nicotiana tabacum + Petunia hybrida межтрибные N. tabacum (Я) +Salpiglossis sinuate (ХП)+ МТ рекомбинантного типа Как ведут себя органеллы у цибридов? Иногда сегрегация происходит очень быстро, иногда для этого нужно до 20 клеточных поколений Получены цибриды: Попытка создать межсемейственный цибрид Solanum nigrum + N. tabacum успехом не увенчались

До завершения сегрегации органелл в клетках соматических гибридов присутствуют пластиды и митохондрии обоих родителей Что происходит с их геномами в этот период? Рекомбинация хлоропластных ДНК– явление крайне редкое, либо редко обнаруживаемое у наземных растений Гораздо чаще рекомбинации хлоропластных ДНК наблюдаются у межвидовых гибридов одноклеточной зеленой водоросли Сhlamydomonas Рекомбинации митохондриальных ДНК удается выявлять значительно чаще, чем хлоропластных. Кроме родительских молекул мтДНК у соматических гибридов, как правило, обнаруживаются также новые последовательности, которые обычно являются результатом рекомбинаций между исходными типами мтДНК

Соматическая гибридизация и замещение клеточных органелл у животных первые спонтанно слившиеся клетки обнаружены Barski и сотрудниками еще в 1960 году, а в середине 60 - х годов получены первые искусственные межвидовые гибриды История гибридизации соматических клеток животных еще более длительная, чем у растений

В гибридных клетках животных была обнаружена рекомбинация митохондриальных ДНК, которая в клеточных гибридах мыши и человека происходит с высокой частотой При клонировании животных только 1-5% реконструированных эмбрионов доживают до взрослых животных Энуклеация ооцита - микроманипуляция

Б ыла найдена корреляция между утратой хромосом одного из родителей гибрида и соответствующей сегрегацией его митохондриальной ДНК При этом утрата мтДНК опережает сегрегацию хромосом одного из родителей С егрегация митохондриальной ДНК мыши в клеточных гибридах мыши и человека была показана у же в ранних работах

Насыщающие скрещивания у животных – долгий и неудобный путь Bos taurus Bos indicus Американские коровы европейского происхождения Быки из Индии Многократное спаривание Ядерный геном постепенно замещался на В. indicus, тогда как митохондрии (которые передаются по материнской линии) - остались от B. taurus П ри экспериментальных попытках замены цитоплазмы у животных прибегают к прямой реконструкции путем переноса ядра в ооцит У широко известной овечки Долли, впервые клонированной из соматической клетки, перенесенной в ооцит другой овцы, м т ДНК отличалась от таковой донора ядра и полностью соответствовала мтДНК ооцита хозяина

Эксперимент по созданию гибридных эмбрионов между Mus musculus L. and Rattus norvegicus L. Предварительная энуклеация Перенос ядра крысы ооцит мыши Развитие цибрида блокируется на стадии 1-2 клеток ооцит мыши Развитие цибрида блокируется на стадии 5-8 клеток ооцит мыши Перенос ядра крысы Перенос цитоплазмы крысы Развитие цибрида идет до стадии морулы Ядро крысы неспособно существовать в цитоплазме мыши

Жизнеспособные «ксеномитохондриальные» цибриды Ядро человека Митохондрии гориллы Митохондрии шимпанзе Митохондрии гориллы Ядро Bos indicus Митохондрии Bos indicus + Bos taurus При дальнейших циклах деления данной цибридной клетки количество копий митохондриальной ДНК Bos indicus быстро уменьшалось, и животное-регенерант, полученное при имплантации в корову зародыша на стадии бластоциста, содержало митохондриальные ДНК исключительно от Bos taurus (разрешающая способность измерений составляла 0,05% мтДНК)

Причина, по которой происходит сегрегация митохондрий B. indicus, неясна; предполагают, что это результат различий в скорости репликации органелл. В эксперименте тех же авторов на гибридной линии мышей наблюдалась стабильная гетероплазмия по мтДНК до 15-го поколения гибридных клеток. ИТАК, п опытки конструирования клеточных химер в ряде случаев увенчались успехом и у животных, и у растений. Практически полезных химер немного. Но – они позволили познать ряд механизмов ядерно-цитоплазматического взаимодействия

Моделирование на уровне геномов органелл (трансформация отдельных генов в геномы органелл) Вехи разработки метода генетической трансформации 60-ые годы – генетическая трансформация ядра – перенос в Е.coli и B.subtilis пластидного rbcL гена и его экспрессия 1987 – разработка метода биолистической трансформации трансформация пластид Chlamydomonas и митохондрий дрожжей трансформация пластид Nicotiana tabacum (3 из 150 обстрелянных растений)

Первая трансформация Chlamydomonas Мутант по гену atpB Обстрел частицами, несущими немутантный аналог гена Восстанавливается нарушенный фотосинтез Транспластомные растения – растения с трансгенами, встроенными в пластидный геном При создании транспластомных растений используют их "прокариотические" черты – чувствительность к антибиотикам, полицистронный тип устройства генома

Что нужно для успешной трансформации пластид? Метод переноса гена через мембрану клетки и двойную мембрану пластид Селективный пластидный маркер, обеспечивающий отбор трансформантов Система культивирования, обеспечивающая эффективную регенерацию

1987 г. - разработан метод «биолистической» трансформации включающего биологические и баллистические приемы Частицы золота или вольфрама диаметром от 0.4 до 1.7 микрона, покрытые ДНК трансформирующих плазмид Частицы проникают в клетки и клеточные органеллы

Во всех экспериментах по трансформации пластид используют обычно двойные мутанты устойчивости к антибиотикам, так как частота спонтанного мутирования пластома достаточно велика Трансформационный вектор пластид pZS148 состоит из pBluescript KS + вектора, в который встроен Sac I–EcoRV фрагмент пластидной РНК. Выделена светлым 16S рДНК. Указаны относительные позиции мутаций резистентности к антибиотикам стрептомицину (str-1) и спектиномицину (spc-2) и Pst1 линкера (*). 2.9-т.п.н. Sal 1 фрагмент включает область, связанную с репликацией (pt ori) al., Признак устойчивости к антибиотику был первым, перенесенным в пластиды табака Из 148 обстрелянных листьев табака было отобрано три транспластомных устойчивых клона

Пластидная ДНК Ген А ген В ген С ген D ген В ген T aadA ген С Трансформационный вектор Пластидная ДНК после трансформации Ген А ген В ген Т aadA ген С ген D ген В ген С A B Включение чужеродного гена (ген Т) в пластом путем генетической трансформации Плазмида встраивается в пластидный геном в строго определенном месте, а именно туда, где находятся последовательности, гомологичные имеющимся в плазмиде Конструкция оказывается стабильно включенной в пластом При создании транспластомных растений используют их "прокариотические" черты – чувствительность к антибиотикам, полицистронный тип устройства генома

Успешной трансформации можно добиться при встраивании гетерологичных последовательностей, если фланкировать их гомологичными ДНК фрагментами Размер фланкирующих гомологичных хпДНК последовательностей с каждой стороны должен составлять не менее 1 т.п.н., размер гетерологичной последовательности при этом может изменяться от 1.3 до 3.7 т.п.н Как удается встроить в пластом чужеродные гены?

4. При трансформации ядерных генов у растений нередко низкий уровень экспрессии трансгенов связан с массой эпигенетических эффектов или механизмом «генного безмолвия» (gene silencing), в пластидах этого не происходит. Почему транспластомные растения перспективнее трансгенных? 1. Высокий уровень экспрессии трансгена и накопления чужеродного белка. Причина - полиплоидность пластидных генетических систем и высокая стабильность чужеродных белков в пластидах. 2. Возможность экспрессировать в пластидах целые бактериальные опероны, отвечающие за какой-либо биосинтетический путь. 3. Трансгены встраиваются в пластидный геном по принципу гомологичной рекомбинации, в ядерный - хаотично. Следовательно, все трансформанты пластид возникающие из одной и той же конструкции, находятся в совершенно равноценном положении и значит не отличаются уровнем экспрессии трансгена 5. Не происходит бесконтрольного переноса пластидных трансгенов с пыльцой (почему?)

Первое практическое биотехнологическое применение транспластомных растений: Экспрессия гена токсина Bacillus thuringiensis в растениях табака: Bt токсин составлял 3-5% от общего растворимого белка клетки Встраивание гена Bt в хлоропластный геном табака Растения проявляли устойчивость к личинкам травоядных насекомых В дальнейшем титр токсина удалось повысить до 45% от общего растворимого белка клетки, при этом в хлоропластах образовывались кристаллы белка-токсина !!! Наблюдалась 100%-ая гибель насекомых после дегустации трансформированных листьев

Еще один пример: наработка транспластомными растениями гормона роста человека - соматотропина Количество гормона достигало до 7% от общего растворимого белка клетки Гормон в пластидах правильно укладывался во вторичную структуру Далее – предполагалось использовать протоколы трансформации пластид для основных пищевых культур Для получения транспластомных растений картофеля и томатов потребовалось еще 10 лет Концентрация рекомбинантного белка в клетке более чем в 300 раз превышала таковую при трансформации данным геном ядерного генома

Получены транспластомные томаты с экспрессией трансгена в плодах (хромопласты) В перспективе: Съедобные вакцины Антитела и другие фармакопрепараты Первые успехи по пластидной трансформации достигнуты у арабидопсиса, риса, видов Brassica plantibodies

Впервые искусственная замена митохондриальной копии гена на ядерную была выполнена на мутантных клетках дрожжей без ATP8 ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ ПЕРЕРАСПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНОВ atp6 atp8 atp9 N m atp6 atp9 N m atp6 atp9 N m Tp N -atp8 art atp6 atp8 Tp N -atp9 N m Sc wt Sc mit - Sc tr Tp N -atp8 art N9/Y8 pLF1 у нейроспоры ген субъединицы 9 переместился в ядро Гены трех субъединиц ATP (6,8,9) у дрожжей находятся в митохондриях Последовательность синтезирована химическим путем in vitro

Последствия инактивации гена ycf3 Reverse genetics – выяснение роли пластидного гена ycf3

Области исследования и практического применения нехромосомной наследственности для улучшения растений