Ингибиторный анализ влияния глицерина на сопряженную ферментную систему NADH:FMN- оксидоредуктаза-люцифераза Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Институт фундаментальной биологии и биотехнологии Кафедра биофизики Кириллова Мария Александровна Руководитель: к.б.н. Суковатая И. Е. Новосибирск 2012

Сопряженная ферментная система NADH:FMN- оксидоредуктаза-люцифераза 2 Бактериальная люцифераза Vibrio harvei (3fgc, ) NAD(P)H:FMN-оксидоредуктаза Vibrio fischeri (1vfr,

Фундаментальная проблема биофизики Структурно-динамическая организация белковых молекул Дизайн среды – направленное изменение физико-химических свойств реакционной среды для функционирования фермента 3

Цель Определить природу взаимодействия альдегидного субстрата сопряженной ферментной системы NAD(P)H:FMN- оксидоредуктаза-люцифераза в условиях вязкой реакционной среды. 4

Материалы и методы Реакционная смесь : 0,05 М фосфатный буфер комплекс ферментов люцифераза - оксидоредуктаза 0,0025% тетрадеканаля водный раствор NADH водный раствор FMNH 2 органический растворитель – глицерин 20 ÷ 70 об.% Измеряемые параметры: интенсивность свечения (I) константа спада (K dec ) 5 Люминометр GloMax ® -20/20 фирмы «Turner BioSystems» (Sunnyvale,USA)

Ингибирование люциферазы глицерином Рисунок 2 - Зависимость максимальной интенсивности свечения сопряженной биолюминисцентной системы от концентрации растворителя при разных концентрациях альдегида: 1 - [C 14 ]=4,7·10 -7 М; 2 - [C 14 ]=4,7·10 -8 М; 3- [C 14 ]=4,7·10 -9 М; 4 - [C 14 ]=4,7· М 6 4

Формально-кинетический анализ Рисунок 3 - Бесконкурентное ингибирование люциферазы глицерином в координатах Иди-Хофсти, где I - интенсивность свечения, [A] - концентрация альдегида

Тип ингибирования – неполностью бесконкурентный Рисунок 4 - График зависимости ординаты точки пересечения графиков бесконкурентного типа ингибирования с вертикальной осью от концентрации глицерина 8

Константа спада k dec =(ln80-ln20)/t. 9 Рисунок 5 - Константа спада при различных концентрациях альдегида С 14 в 30%-глицерине

Гидрофобное взаимодействие 10 Рисунок 6 - График зависимости константы Михаэлиса от концентрации ингибитора

Эффективность реакции Е= K m /K dec 11 Рисунок 7 – Зависимость эффективности реакции от концентрации глицерина

Выводы 1.Природа взаимодействий глицерина и люциферазы по отношению к альдегидному субстрату в исследуемой системе определена преимущественно гидрофобной 2.Тип ингибирования определен как неполностью бесконкурентный 3.Стабилизация долгоживущего интермедиата реакции наблюдается 4.Сродство альдегида к люциферазе максимально при концентрации глицерина 30 об. %, 5.Эффективность функционирования биолюминесцентной системы максимальна в среде с концентрацией глицерина 30 об. % 12