Лекция 8. РНК-редактирование Редактирование митохондриальной мРНК кинетопластных простейших Эдитинг митохондриальной мРНК плесневого гриба Physarum polycephalum Эдитинг митохондриальных мРНК растений Редактирование структурных РНК Эдитинг хлоропластных мРНК растений Происхождение и эволюция РНК-редактирования Понятие о РНК-редактировании

ДНК иРНК БЕЛОК ые гг 70-ые гг ДНК иРНК БЕЛОК Обратная транскрипция ДНК пре иРНК РНК БЕЛОК Сплайсинг, процессинг РНК- эдитинг Этапы крушения центральной догмы молекулярной генетики 80-ые гг. 90-ые гг. (1986)

Такая "правка" ДНК матриц на уровне мРНК получила название РНК-редактирование (RNA-editing) В 1986 году изменения последовательностей информационной РНК (мРНК), ведущие к модификации ДНК-кодируемой информации, были обнаружены в митохондриях паразитических простейших – трипаносом Эти вставки приводили к изменению информационного контекста по сравнению с закодированным в ДНК-молекуле В мРНК наблюдались вставки или (реже) делеции уридиновых нуклеотидов

От 5 до сцепленных миниколец кодируют все остальные guide-РНК. Количество различных генов РНК-проводников в клетках видоспецифично, их бывает до 300. Митохондриальная ДНК трипаносом и других кинетопластных простейших, называемая кинетопластной ДНК, состоит из комплекса больших и малых колец Приблизительно 50 сцепленных максиколец размером тпн содержат структурные и рРНК гены и несколько специальных генов РНК-проводников (guide-РНК)

Из 20 генов мтДНК трипаносом 12 редактируются

Они способны образовывать короткие "якорные" дуплексы с пре-редактируемой РНК вблизи участка эдитинга РНК-проводники являются комплементарными – "антисмысловыми" к участкам редактируемых мРНК

Вставки и делеции уридиновых (U) нуклеотидов, обычно в кодирующие районы mRNA транскриптов митохондриального генома трипаносом

мРНК перед эдитингом GCGGAGAAAAAAGAAAGGGUCUUUUAAUG AAA (N) 3' 5' : : : 3 UUUUUUUUUU CAGAAAAUUAC 5' РНК- OH U A проводник U C (quide R NA) A A Поли-U C U Якорь конец U A U U ЭДИТИНГ Отредактированная мРНК ' GCGGAGAAAAAAUGAAAUGUGUUGUCUUUUAAUG AAA 3' 3' UUUUUUUUUUUUUACUUUAUACAACAGAAAAUUAC 5' OH Guide RNA Предполагаемая структура РНК-проводника (guide RNA), гибридизирующегося с пре-редактированной и редактированной мРНК Последовательность gRNA между двумя дуплексами определяет эдитинг в сайтах с 1 по 4. Эдитинг закончен, когда достигается полная гибридизация между молекулами :

Всего в митохондриальных РНК Physarum обнаружено около 1000 точек эдитинга, причем они располагаются не только в белок- кодирующих матрицах, но и в рРНК, и в тРНК. Редактирование митохондриальных транскриптов миксомицета Physarum polycephalum Myxomycota – древние эукариоты, Myxomycota – древние эукариоты, одни из первых «обладателей» митохондрий

Обнаружены также инсерции динуклеотидов: GC, GU, CU, AU, AA Редактирование Physarum происходит в основном путем инсерций цитидина. В одной молекуле мРНК α-АТФазы было обнаружено 54 некодированных цитидинов. Вставки наблюдаются в среднем через каждые нуклеотидов, в рРНК – через ~45 нуклеотидов От 9 до 64 нуклеотидов встраиваются в мРНК матрицы Physarum

Инсерции мРНК происходят по позициям, находящимся на расстоянии не далее нуклеотидов от сайта, который в это время транскрибируется (а возможно и гораздо ближе) Редактирование у миксомицетов каким-то образом связано с транскрипцией Механизмы узнавания сайтов и биохимические процессы эдитинга у Physarum пока неясны. ??? В плазмидах, содержащихся в митохондриях Physarum, сайты эдитинга не обнаруживаются, что свидетельствует об ином происхождении плазмид

Редактирование митохондриальных мРНК растений было обнаружено одновременно в трех лабораториях В митохондриальных генах растений CGG CGG в универсальном генетическом коде определяет аргинин триптофан Почему? Неуниверсальность генетического кода в митохондриях растений? Загадка разрешилась после секвенирования кДНК этих генов: во многих сайтах мРНК были обнаружены C – U замены

Ген С-U замены К-во сайтов эд. / 1000п.н. Модифи цировано аминокислот % модифицир. аминокислот nad11717,4144,3 nad2 3624,5286,5 nad3 2159,32213,5 nad42315,5224,5 nad5115,5101,5 nad61523,493,6 nad7 3227,1276,9 nad91424,3126,2 atp9833,356,8 cob1841,3174,3 cox21721,8155,8 cox3 1215,1124,5 rps1 4 7,842,3 rps2 7 6,471,9 rps ,8 orf ,531,9 orf ,93215,5 orf ,73313,8 orf ,730 5,2 Оказалось, что эдитингу подвергаются все гены, кодируемые митохондриальной ДНК растений, причем по множеству сайтов Сайты эдитинга белок-кодирующих областей митохондриальных транскриптов пшеницы

Распределение сайтов эдитинга может быть весьма гетерогенным – даже в различных экзонах одного и того же гена nad 4 nad 5 Каждая стрелка соответствует одному сайту эдитинга Сайты эдитинга в транскриптах некоторых митохондриально кодируемых субъединиц Комплекса 1 у пшеницы

У некоторых видов выявлено более 400 точек C – U конверсий митохондриальной мРНК только в четырех случаях обнаружены обратные превращения U – C: в мРНК генов cox3 пшеницы cox2 гороха и энотеры cob энотеры

C–U превращения, чаще всего происходящие при эдитинге, могут значительно изменить рамки считывания Описаны случаи появления новых рамок считывания: (ACG) C–U (AUG), тре мет образования стоп-кодонов: глу CAA UAA глу CAG UAG арг CGA UGA (U–C эдитинг у Ceratophyllum наоборот, аннулирует стоп-кодоны) изменение аминокислотных последовательностей белков Идентификация точек эдитинга в какой-то ORF указывает на то, что данная рамка считывания, скорее всего, является функционирующим геном. Обрывание рамки считывания

В митохондриальных транскриптах пшеницы 14 процентов нуклеотидных замен (56 сайтов) оказываются нейтральными и не ведут к аминокислотным изменениям в белках Чем вызвана необходимость эдитинга в этих сайтах ??? Возможно, редактирование приводит к изменению конформации молекул, что облегчает связь с рибосомами ???

Пока не удалось выявить ни какой-либо консенсусной последовательности, ни какого-то мотива во вторичной структуре, который мог бы служить "указателем" сайта эдитинга Например, в транскрипте orf206 редактируется до 68 цитидинов – это 25% всех цитидинов в мРНК orf206. Какой механизм определяет редактирование определенного цитидина, а не соседнего с ним? Чем определяется специфичность эдитинга ???

Скорее всего, будут найдены РНК-молекулы, которые могут действовать как транс- детерминанты (подобно gРHK у кинетопластов), так и цис-детерминанты, образующие специфическую вторичную структуру, узнаваемую ферментами эдитинга В митохондриальных мРНК растений огромное количество сайтов эдитинга ( точек) Маловероятно наличие специфических белковых молекул, узнающих каждая свой сайт

Информационная емкость генома митохондрий высших растений вполне достаточна для кодирования gРHK. Однако, скрининг митохондриального генома у Arabidopsis ( нуклеотидов с неустановленной функцией) не выявил антисмысловых последовательностей, которые могли выполнять роль gРНК. Интересно, что у маршанции, у которой отсутствует мРНК эдитинг в митохондриях, "излишней" ДНК значительно меньше – нуклеотидов Где же «прячутся» guide РНК в митохондриальном геноме растений?

Обычно редактирование мРНК и сплайсинг интронов – два посттранскрипционных процесса, которые происходят параллельно и независимо друг от друга Если сайты эдитинга расположены в самих интронных последовательностях – редактирование предшествует сплайсингу Как соотносятся процессы сплайсинга и эдитинга?

В большинстве случаев эдитинг белок-кодирующих сайтов приводит к синтезу функционально полноценных белков У табака нарушение эдитинга atp9 мРНК препятствует развитию пыльцы У пшеницы эдитинг гена cox2 по 235 нуклеотиду превращает треониновый кодон в метиониновый. Метионин незаменим в структуре одного из медь- связывающих доменов COX2 У генов пшеницы orf575 и orf240 эдитинг приводит к замене аргининовых кодонов на триптофановые. Восстанавливается консенсусная последовательность в обоих белках, необходимая для связывания с гемом

Редактирование структурных РНК посттранскрипционным изменениям могут подвергаться не только информационные, но и транспортные РНК митохондриально кодируемые ядерно кодируемые тРНК Ala дезаминируют 37-ой аденозин антикодоновой петли эукариот в инозин A I Данный сайт редактирования обладает поразительным филогенетическим долголетием – он сохранился в клетках от дрожжей до человека

A A A A A A A U U G A C G A C G A C G A C G-C A G*U G U C A-U A C U G U C G-C A U U G U C A-U A U G-C A U U U-A U-A C-G C-G G-C U*G A-U G- C C-G C-G A-U G-C A-U U-A C-G U-A U-A C-G A-U A-U U-A A-U A-U A-U Акцепторные участки тРНК Митохондриальные тРНК простейшего Acanthamoeba Точки тРНК эдитинга были предсказаны, а затем все они были найдены Редактирование восстанавливает комплементарность оснований Наблюдаются замены: U – A, G – A, A – G, U – G и U – C Механизм нахождения точек эдитинга как-то связан с вторичной структурой тРНК

Редактирование тРНК матриц может изменять кодон-специфичность мт-тРНК Asp Антикодон GCC Антикодон GUC C U нередактир. редактир. глицин аспарагин Didelphis (опоссум) Ген считался аспарагиновым по гомологии с др. млекопитающими мт-тРНК Gly обычно узнает 4 кодона - GGN, а у опоссума только 2 - GGА и GGG мт-тРНК Asp после эдитинга узнает 2 глициновых кодона - GGС и GGU

У высших растений описано 4 случая тРНК эдитинга: У всех видов тРНК эдитинг предшествует процессингу, затем наблюдается быстрый процессинг отредактированных молекул, не прошедшие эдитинг тРНК не связываются с аминокислотами и деградируют тРНК Phe тРНК Cys тРНК Phe бобыкартофельэнотера тРНК His лиственница – первый известный случай тРНК эдитинга у голосеменных

53 53 тРНК Phe 5 ДНК 3 т-РНК- предшественник С А транскрипция РНК-эдитинг эдитосома U А РНК- процессинг CCA достройка ACCACC U А Зрелая молекула Формирование фенилаланиновой тРНК в митохондриях растений – многоступенчатый процесс

РНК-редактирование хлоропластного генома кукурузы В рамках гены с сайтами эдитинга, числа в скобках – количество сайтов эдитинга в гене

В хлоропластном геноме значительно меньше сайтов эдитинга, чем в митохондриальном геноме растений Хп кукурузы – 27 сайтов эд. Хп табака – 31 сайт Мт кукурузы – найдено 364 сайта, предполагается > 1200 cайтов Во всех случаях эдитинга хлоропластной мРНК высших растений выявлены только C-U превращения, тогда как у низших растений обнаружены также U – C замены Проблема специфичности, т.е. нахождения сайтов эдитинга не решена ни для митохондриальной, ни для пластидной мРНК растений

Сходство пластидных и митохондриальных систем РНК-эдитинга у растений Основной тип превращений как в митохондриальных, так и в хлоропластных РНК: C-U эдитинг Крайне редко в обоих типах органелл отмечается U – C эдитинг Наиболее часто редактируются вторые нуклеотиды кодонов, часто наблюдаются определенные типы превращений эдитингу подвергаются преимущественно мРНК редкие случаи эдитинга описаны для митохондриальных тРНК, ни одного такого случая до сих пор не зафиксировано в пластидах

был впервые открыт при анализе экспрессии гена аполипопротеина В (apoB) печень тонкий кишечник CAA CAA UAA (стоп-кодон) нередактиров. мРНК редактирование 6666-го нуклеотида apo B100 (512 kDa) apo B48 (241 kDa) Эдитинг у млекопитающих apoB мРНК

Два белка, синтезирующиеся на apo B матрице, выполняют различную роль в метаболизме липидов apo B48 задействован в транспорте жиров, поступающих с пищей и всасывающихся в кишечнике apo B100 вовлечен в транспорт эндогенно синтезированных триглицеридов и холестерола Оказалось, что катализирует превращение цитидина в уридин фермент, названный APOBECI и являющийся цинк-содержащей цитидин дезаминазой с молекулярным весом 27 kDa

Был клонирован ген, кодирующий APOBECI у человека, показана его локализация на 12-ой хромосоме Экспериментально созданные трансгенные кролики и мыши экспрессировали данный ген в печени, что приводило к "гиперэдитингу" – редактированию других цитозинов в apoB мРНК и даже других мРНК Это вызывало серьезные нарушения функционирования печени вплоть до канцерогенеза

Описан эдитинг гена чувствительности к опухоли Вильмса WT1 Происходит редкое превращение U–C Leu-280 (CUC) заменяется на пролиновый (CCC) подавляется ингибирующее действие WT1 фактора, что может иметь значение в генезе опухоли Редактирование ядерных мРНК

Поиск точек РНК-редактирования (ткани мозга человека) Участки генома Секвенировано оснований Точек эдитинга Эдит./ т.п.н. Межгенные346, Экзоны (транслируемые) 541,77200 Интроны Экзоны (5нетранслируемые) 50,12900 Экзоны (3нетранслируемые) 310,55929 Неизвестные 313, ВСЕГО 3,049, Все точки эдитинга были А-I заменами Проанализировано 6768 кДНК клонов

ТаксонТип эдитингаКлеточный компартмент TrypanosomaU инсерции/делециимитохондрии Acanthamoeba castellani Spizellomyces punctatus U-A, G-A, A-G, U-G, U-Cмитохондрии Physarum polycephalum инсерции нуклеотидов ( в основном С), С-U конверсии митохондрии Дельта вирус гепатита человека A - I конверсияцитоплазма хозяина Вирусы EbolaA инсерцияцитоплазма хозяина ПарамиксовирусыG инсерцияцитоплазма хозяина Высшие растенияС - U конверсии U - С конверсии митохондрии Высшие растенияС - U конверсиихлоропласты МлекопитающиеС – U; A – I; U- C; G - A U-A конверсии ядро Улитки, однопроходные, сумчатые Различные нуклеотидные конверсии митохондрии Drosophila melanogaster A –I конверсииядро

В различных генетических системах в редактировании задействованы совершенно непохожие механизмы: вероятно, мРНК эдитинг неоднократно возникал заново в эволюции Является ли эдитинг "реликтом" пребиотического РНК-ого мира или это позднейшее приобретение ??? Отсутствие эдитинга в органеллах водорослей и некоторых других низших растений говорит в пользу более позднего его появления Возникновение эдитинга часто связывают с выходом растений на сушу. Действительно, редактирование выявлено во всех группах наземных растений

вода земля зеленые водоросли Сharales 4 вида печеночники нет эдитинга эдитинг Marchantiidae 7 видов Jungermannidae мхи Hornworts ( Anthoceros ) семенные растения папоротники Fern allies Эдитинг наблюдается только у наземных растений

Возникновение РНК-эдитинга в эволюции и его разнообразные проявления во многих генетических системах являются пока во многом непонятным феноменом РНК-эдитинг – строго специфическое посттранскрипционное изменение информационных и структурных РНК, состоящее во вставках, заменах и выпадениях нуклеотидов Редактирование - необычный, сложный, требующий координирования большого количества факторов, энергоемкий генетический процесс Во многих системах роль эдитинга остается загадкой