Инструменты генетического анализа Классическая генетика: Метод Меллер-5 - детекция леталей хромосомные компаунды – детекция нерасхождения хромосом Y-аутосомные транслокации – сегментная анеуплоидия T(A,Y)1 T(A,Y)2 С помощью этого метода была получена анеуплоидия по всем участкам хромосом дрозофилы Были обнаружены все локусы, которые в гаплоидном состоянии приводят к летальности – гапло-чувствительные локусы. Исторически это первый случай, когда было выполнено полногеномное исследование.

Мозаичный анализ: наличие маркеров в данной ткани, например mwh в крыле позволяет увидеть крыловой фенотип в мозаичном клоне для мутаций, которые летальны в эмбриогенезе или на стадии личинки. mwh X + + Митотический кроссинговер, просмотр морфологии клонов, гомозиготных по mwh. X X X

Молекулярные инструменты генетического анализа Ловушка энхансеров P{lArB} 5 3 LacZAdh ry+ PL3 Геномная ДНК X Δ2-3 TM3,Sb P{lArB} CyO Δ2-3 TM6,Tb ry + If + P{lArB} If TM6,Tb ry X ry TM6,Tb ry ry P{lArB}(ry + )If + Jump starter males Событие инсерции

Локализация клеток имагинальных дисков дрозофилы, в которых экспрессируется ген lacZ

Структура плазмиды (а) и метод «спасения» плазмиды (б)

Энхансерная ловушка у растений Arabidopsis thaliana является наиболее развитым в отношении генной инженерии растительным объектом. У этого растения достаточно легко можно проводить получение новых трансформантов с помощью агробактериального переноса. Но энхансерная ловушка тоже была сконструирована, поскольку не для всех растительных объектов агроперенос возможен. Ac транспозаза под контролем убиквитиного промотора, в Ds элемент вставлен GUS (-glucuronidase) под контролем миниамльного CaMV 35S промотора. Частота транспозиций у риса 1%-15% в зависимости от используемых линий. Частота перемещений энхансерной ловушки у дрозофилы ~ 1%, это не много. Но перемещать ловушку по геному в скрещиваниях много проще, чем заново проводить трансформацию. Именно этим путем было проведено насыщение инсерциями генома дрозофилы в геномном проекте.

Достоинства этой системы: можно подставлять разные драйверы под один и тот же UAS-трансген и экспрессировать его в разных тканях, введение промежуточного GAL4 позволяет амплифицировать (усилить) сигнал. Gal4-UAS система – это ловушка энхансеров, разбитая на две части.

Но есть и еще одно преимущество – можно под один драйвер подставлять UAS конструкты, несущие разные белки. Это создало новую возможность для генетической диссекции функции мисс-экспрессионный скрининг. EP – элемент это транспозон содержащий UAS промотор, он «подчиняет» экспрессию гена Gal4 драйверу.

Попытка создания Gal4-UAS системы на растения (табак) встретилась с трудностями. Как оказалось, сайт связавания Gal4 в UAS промоторе, метилируется у этого вида, что предотвращает работу этой системы. На Arabidopsis эта проблема менее значима, что дает возможность проводить работы по созданию коллекций драйверов, аналогичных имеющимся у дрозофилы. EP элементы у растений пока не созданы.

Ловушки генов и белков. Двойное попадание в ген (dual tagging gene trap) Gal4 гибридный белок можно использовать для выяснения в какой ткани экспрессируется ген в который попала ловушка. W + гибридный белок служит для индикации того, попала ли ловушка в ген, поскольку polyA сигнал будет добавлен только в этом случае. Сайты сплайсинга

Метод GFP-белковой ловушки Экзон 1 Интрон 1Интрон 2 P 5ген GFPP 3 сайты сплайсинга GFP PDI Интрон-экзонное структура гена Сплайсинг мРНК GFP-гибридный белок Полноразмерный транскрипт Копия экзона 1 Копия экзона 2 Копия экзона 3 Экзон 2 Экзон 3

FLP-FRT система для искусственной митотической рекомбинации hs-FLP При индукции FLP рекомбиназы происходит митотический обмен между двумя одинаково ориентированными FLP сайтами. Это событие на стадии 4-х хроматид. Эта система была создана для того, чтобы можно было «огомозиготить» любую мутацию в мозаичном клоне. Это важно для летальных мутаций, когда нельзя получить гомозигот. Применение системы для маркирования мозаичного клона в ткани: FRT промотор GFP- белок GFP белок будет работать если спейсер удален.

Направленное получение делеций Создание коллекции инсерций RS1 и RS2 элементов: Секвенирование геномной ДНК, прилежащей к встройкам, позволяет охарактеризовать сайт встройки с точностью до нуклеотида. hs-FLP делеция с известными точками разрыва возникает вследствие митотичекого кроссинговера в гонадах. Хромосому можно найти при анализе потомства по двум дозам w +. w + w+w+ w+w+ w+w+ w+w+ RS1 RS2 w+w+ w+w+ Коллекция RS1

Получение направленных делеций у растений началось раньше, чем у дрозофилы. Использовали Ds транспозон, содержащий Lox-P сайт. Перемещения внутри генома вызывали с помощью Ac транспозазы. Вместо FLP рекомбиназы была использована Cre рекомбиназа.

Направленный мутагенез Под действием FLP-рекомбиназы конструкция выщепляется из хромосомы. Искусственная homming нуклеаза индуцируется с помощью hs-I-SceI конструкта и расщепляет экстрахромосомную ДНК по сайту I-SceI: CAAAACGTCGTGAGACAGTTTG (рекомбиногенный разрыв). Это приводит к рекомбинации пробного гена (белые прямоугольники) и гомологичной геномной мишени (черные прямоугольники). Встройки находят по маркеру w +

Сайленсиг генов с помощью РНК интерференции У животных имеется защита от РНК-содержащих вирусов. При попадании двуцепочечной РНК в клетку она фрагментируется на на п.н. участки под действием РНКзы Dicer2. Это явление используется для индукции сайленсинга генов. ген транскрипт белок РНК-и конструкт +Dicer2 Деградация транскриптов, белка нет. РНК-и транскрипт комплементарно залипает на транскрипте гена

Ловушка белок-белковых взаимодействий – дрожжевая дигибридная система. α A B Ген репортер Транскрипционный фактор с сайтами A и B в плазмиде α Приготовим плазмиду, cодержащую изучаемый белок X сшитый с фрагментом, содержащим сайт A. β A X A X Приготовим «библиотеку» всех белков Y, пришитых к сайту B в плазмиде γ γ Y B Y B

Трансформируем клетку дрожжей, такими концентрациями плазмидных ДНК, чтобы в клетку попало только одна копия плазмиды γ. α Ген репортер A X Y B Если белок Y из библиотеки физически взаимодействует с изучаемым белком X, то соберется транскрипционный фактор, который начнет транскрипцию гена-репортера. Это позволит увидеть клетки в которых имеются белки, взаимодействующие с X.

Фаговый дисплей В ген, кодирующий белок оболочки pIII вставляют библиотеку случайных последовательностей из 12 нуклеотидов. После заражения E. coli фагом с низкой плотностью полу- чают библиотек фагов. Каждый фаг несет свой вариант оболочечного белка. Все пептиды представлены частицами фага. Библиотеку используют для отбора фагов связывающихся с определенным субстратом.

Исследование взаимодействия белков с помощью FRET

Трансгенез Схема действия и внешний вид «генной пушки» Р.К. Саляева

Ускорение роста осины в результате совместного введения генов ugt и acb в ее геном

Метод GFP-белковой ловушки Экзон 1 Интрон 1Интрон 2 P 5ген GFPP 3 сайты сплайсинга GFP PDI Интрон-экзонное структура гена Сплайсинг мРНК GFP-гибридный белок Полноразмерный транскрипт Копия экзона 1 Копия экзона 2 Копия экзона 3 Экзон 2 Экзон 3