Лекция 7 Взаимодействие геномов клетки Мутации пластидной и митохондриальной ДНК 1. Участие генов ядра в репликации и экспрессии пластидной ДНК Р Ретроградная регуляция Механизмы внутриклеточного распределения продуктов ядерных генов 4. Спонтанные мутации органельных геномов И Индуцированные мутации органельной ДНК М Мутации, вызванные ядерными генами-мутаторами 5. Культивирование растений in vitro и мутации

Типы генов в органеллах и у свободноживущих предшественников Фотосинтез и дыхание Трансляция Биосинтез кофакторов Биосинтез аминокислот Клеточные процессы Транспорт.и пермеазы Метаболизм липидов Транскрипция Регулят. функции Энерг. метаболизм Биосинтез нуклеотидов Репликация и репарация ДНК число генов в геноме Synechocystis пластиды Rickettsia митохондрии

Взаимодействие ядерного и органельного геномов – на каждом этапе развития органелл I - Ядерные гены участвуют в образовании и жизнедеятельности органелл: репликация ДНК органелл осуществляется ферментами ядерного кодирования и специальными белковыми факторами; транскрипция и трансляция осуществляется в большинстве случаев ферментами ядерного кодирования и специальными белковыми факторами ; процессинг, сплайсинг, РНК-редактирование органельных генов выполняют в основном ферменты ядерного кодирования.

II. Ядерные геномы совместно с органельными кодируют субъединицы белков либо отдельных белков сложных многокомпонентных комплексов: Мт животных ND 7 – 35 COB 1 – 10 COX 3 – 10 ATP 2 – 14 Пластиды высших растений RbcL – хпДНК мтДНК яДНК RbcS - яДНК РНК и белки рибосом – совместное кодирование у всех эукариот Самые яркие примеры

Развитие хлоропластов из пропластид происходит под воздействием внешних сигналов хлоропласт Про- пластида свет координированная экспрессия ядерных и пластидных генов

Cхема биогенеза пластид и ядерно- хлоропластного взаимодействия геномов

Мутанты gun (genome uncoupled) c нарушенной ядерно- пластидной координацией экспрессируют ряд ядерных фотогенов в условиях, когда развитие пластид подавлено Ядерные "фотогены" – гены, экспрессия которых зависит от света контролируют в основном компоненты фотосинтетического аппарата при отсутствии света либо полностью блокированы, либо экспрессируются на очень низком уровне При освещении экспрессия их возрастает в 100 и более раз

пластиды индуцируют какой-то сигнал, необходимый для экспрессии фотосинтетических генов ядра Гипотеза: Регулирующая роль ядерных генов в функционировании пластид является бесспорной. Верно ли обратное – зависит ли экспрессия ядерных генов от процессов, происходящих в пластидах? Что это за сигнал?

Эффект отмечен только при воздействии до 48 часов от начала прорастания тагетитоксин (транскрипция) Снижение транскрипции ряда генов ядра (rbcS и др.) Норфлуразон (фотодеструкция хп) Хлорамфеникол (трансляция) Влияние пластид на экспрессию генов ядра Вероятно, пластидный сигнал формируется с участием какого-то продукта ранней экспрессии пластидного генома (до часов от начала прорастания) Эксперименты на проростках горчицы Вещества- ингибиторы

В некоторых случаях пластидный сигнал может регулировать экспрессию ядерных генов и в отсутствие света Показано, что экспрессия одних генов ядра растений в большей степени изменяется при повреждении пластид по сравнению с другими генами Существуют множественные сигнальные пути от хлоропластов к ядру ядро

гено-специфичными элементами промоторов ядерных генов Природа регуляторных сигналов пока не известна, однако очевидно, что они воспринимаются 5 UTR Пластидный сигнал 1 Пластидный сигнал 2 Ядерный ген N

Наиболее детально процесс взаимодействия геномов ядра и митохондрий изучен у дрожжей Специфические белки – активаторы трансляции митохондриальных генов, взаимодействуют с 5- UTR областями митохондриальных транскриптов активаторы выявлены практически для всех мт генов они могут регулироваться внешними факторами, что позволяет адаптировать трансляцию к изменяющимся условиям среды

Функциональное состояние митохондрий влияет на экспрессию ядерного генома Ретроградная регуляция: количество белков, импортируемых в митохондрии из цитозоля для нормального функционирования клетки – до 4 тысяч При этом нужно учитывать, что ядро мт

полноценный мт геном делеция в 1 гене сохранилось 700пн от всего мт генома мт геном потерян Экспрессия одних ядерных генов различается между мутантными штаммами 4 штамма дрожжей с одинаковым ядерным геномом, но с разным состоянием генома митохондрий Экспрессия других ядерных генов не зависит от изменений в мтДНК

При митохондриальных дисфункциях экспрессия СIT1 не меняется, а СIT2 увеличивается в раз. Данная регуляция осуществляется с помощью специальных генов группы RTG. Изменение экспрессии гена цитратсинтазы СIT2 дрожжей - самый изученный пример ретроградной регуляции СIT2 СIT1 75%-ое сходство Mit СIT Древний ген в мт Перенос гена в ядро Дупликация гена в ядре СIT1 и СIT2

Самая сложная внутриклеточная регуляция экспрессии генов у растений – 3 генома; У двух видов растений: арабидопсиса и бобов - идентифицировали ядерные гены, контролирующие число копий митохондриальной ДНК в клетке; Механизмы ядерно-плазменного взаимодействия - множественные, на всех уровнях экспрессии генома Несмотря на ряд интересных фактов, понимание взаимодействия геномов клетки у растений находится пока на зачаточном состоянии.

Механизмы внутриклеточного распределения продуктов ядерных генов При этом ряд мт белков не имеет в ядре собственных генов, а транскрибируется с тех же матриц, что и цитоплазматические белки Более 90% мт белков кодируется ядром и транслируется на цитоплазматических рибосомах Как направляются в митохондрии такие белки?

Регуляторные механизмы локализации белков внутри клетки Митохондриальный белок Mod5 Ядерный белок Mod5 MOD5 UTR. 5 3 AUG(+31)AUG(+1) B. Митохондриальный HTS Цитоплазматический HTS HTS UTR AUG(+61) AUG(+1) A. При транскрипции гена тРНК-синтетазы образуются две мРНК различной длины Различаются дополнительной последовательностью на 5 конце – митохондриальный сигнал С одной мРНК молекулы – два белка, т.к. два инициирующих кодона Первый способ регуляции – более универсальный

Cпонтанные мутации органельных геномов были обнаружены раньше, чем появилась наука о нехромосомной наследственности Пестролистность – первые описанные спонтанные мутации пластома Цитоплазматическая стерильность пыльцы – первые описанные спонтанные мутации митохондриального генома

Пестролистность в основном изучалась у родов Antirrhinum и Oenothera. Пестролистные растения в популяции Oenothera появлялись примерно с частотой ~ 0,3% Частота спонтанных мутаций хлорофилл-дефектности в пластоме колеблется у разных видов и составляет в среднем %

Пестролистные формы получены для самых разных декоративных видов растений

Пластидные мутации по своему фенотипическому проявлению делятся на три основные группы: 1)c нарушениями в световой и темновой фазах фотосинтеза и/или дефектной окраской листьев – от светло-зеленых до белых; 2)с приобретенной резистентностью к гербицидам; 3)с приобретенной резистентностью к антибиотикам

В хлоропластах четырех видов Сhlamydomonas было обнаружено большее разнообразие геномных перестроек, чем описано для более чем 200 видов наземных растений Одноклеточная зеленая водоросль Chlamydomonas - классический объект для изучения пластидных мутаций в 50-60ые годы C. reinhardtii, C. smithii, C. eugametos, C. moewusii Рут Сэджер – автор классических работ по хлоропластной генетике Сhlamydomonas

Были обнаружены несколько классов мутаций: 1)плейотропные мутации - к ним относятся petite – мутации дыхательной недостаточности, а также мутации mit, - имеющие фенотип petite, но сохранившие систему митохондриального белкового синтеза 2)мутации антибиотикоустойчивости Митохондриальные мутации интенсивно изучались на культурах дрожжей, нейроспоры и других грибов

Ядерная ДНК высших растений Ядерная ДНК млекопитающих Частота точковых мутаций ~~~~ митохондриальная ДНК млекопитающих митохондриальная ДНК высших растений В раз выше, чем у растений Примерно одинакова

Ядерные ДНК покрытосеменных изменяются в 2 раза быстрее, чем хлоропластные, а хлоропластные в 3 раза быстрее, чем митохондриальные ДНК. мт хп я Частота точечных мутаций Митохондриальная ДНК покрытосеменных – самая стабильная часть клеточного генома

частота нуклеотидных замен в этих районах по крайней мере в три-четыре раза ниже, чем в остальных Большие инвертированные повторы хлоропластной ДНК отличаются повышенной стабильностью Является ли этот феномен результатом более низкой частоты мутирования? или следствием более эффективной репарации возникших замен с сохранением абсолютной идентичности обеих копий? Пока неясно

Почему митохондриальные ДНК высших растений имеют необычно низкий уровень точковых мутаций ? Высокая точность ДНК-полимеразы? Высокая репарационная активность? Ответа пока нет

Из 281 проанализированных видов покрытосеменных у двух – Pelargonium hortorum и Plantago rugelii уровень спонтанных мутаций мтДНК оказался в десятки раз выше, чем у всех остальных, приближаясь к таковому в мтДНК позвоночных. Хлоропластные ДНК этих двух видов практически не отличаются от других по уровню спонтанных мутаций, так что эти виды нельзя отнести к быстро эволюционирующим ???!!!???!!!

Три инверсии отличают хпДНК табака от хпДНК риса Структурные перестройки генома В то время как митохондриальные ДНК высших растений отличаются значительной вариабельностью размеров и структуры молекул, порядок генов в хлоропластной ДНК высших растений почти не изменялся. Так, Marchantia, отделенная от табака по крайней мере 400 миллионами лет эволюции, имеет всего одну инверсию в хлоропластном геноме. Три инверсии отличают хпДНК табака от хпДНК риса (рис.9.1). В то же время, митохондриальный геном двух различных цитоплазм (Т и N) кукурузы, разделенных не более 100 тыс. лет эволюции, различается не менее чем 30 перестройками [Palmer, 1990]. Вариабельность размеров и структуры молекул Порядок генов в хлоропластной ДНК высших растений почти не изменялся Митохондрии Хлоропласты Marchantia Nicotiana 400 млн лет эволюции Одна инверсия в хлоропластном геноме

В целом, хлоропластный геном эволюционирует по принципу «используй или избавляйся» use it or loose it Малое количество псевдогенов, утрата фотосинтетических генов растениями - паразитами Утрата половины пластидного генома бесцветной эвгленоидной водорослью Astasia longa

В то же время в самих пластидах Epiphagus эти гены элиминируются Мито - склад неиспользуемых последовательностей В митохондриях Epiphagus сохраняются ряд фотосинтетических генов пластидного происхождения

Горячие точки при структурных реорганизациях органельных геномов Сравнение структурных мутаций у родственных видов и родов растений показывает, что чаще всего они происходят в определенных местах – так называемых горячих точках (hot spot) Природа горячих точек не выяснена Возможно, они связаны с наличием коротких повторяющихся последовательностей ??? Возможной причиной горячих точек в хлоропластном геноме являются АТ- богатые области ДНК молекулы

В митохондриальных геномах самых разных организмов, начиная от дрожжей и кончая высшими эукариотами, в т.ч. человеком, обнаруживаются крупные делеции Эти мутации существуют обычно в гетероплазматическом состоянии Горячие точки при возникновении этих делеций связывают (как и для хлоропластной ДНК) с повторами в митохондриальном геноме

Прямой повтор длиной 13 пар нуклеотидов причинно связан с возникновением крупной (5 т.п.н.) делеции в митохондриальной ДНК человека ААGCCCATAAAAATAAAAATTATAACAAACCCTGAGA…………..ACTCAAAACCATACCTCTCACTTCAACCTCCCTCACCA 13 п.о п.н. CTAAAAATATTAAACACAAACTACCACCT ACCTCCCTCACCA TTGGCAGCCTAGCATTAGCAGGAATACCTTTCCTCACAGGT AT п.о. ATPase 8 (8.482) (13.460) ND5 L K M L N T N Y H L P P S P L A A * Но! Три из четырех 13-нуклеотидных повторов не связаны ни с какими крупными делециями

Индуцированные мутации органельных геномов Цель индуцирования мутаций органелл: понять, как устроены и как экспрессируются органельные геномы попытаться решить ряд прагматических задач урожайность устойчивость к разным стрессам синтез определенных необходимых человеку веществ

Индукция органельных мутаций химическими мутагенами интеркалирующие в ДНК флуоресцентные красители Использовали: нитрозосоединения оказались наиболее эффективными антибиотики бромистый этидий и акридины N-нитрозо-N-метил-мочевина (НММ) и N-нитрозо-N-этил-мочевина (НЭМ)

NO O CH3NCNH2 chlorina подсолнечника Мт ДНК крыс мтДНК нейроспора Мт ДНК дрожжей ???

Реорганизация хлоропластной ДНК у мутантов подсолнечника, индуцированных нитрозо-метил мочевиной (рестриктный анализ с эндонуклеазой HindIII) λ/Pst λ/HindIII chl1 chl2 chl3 chl5 chl6 chl7 N chl8 chl9 chl10 chl11 chl12 N

Мутации органельных геномов, индуцированные ядерными генами-мутаторами У разных видов растений описаны природные изоляты, в которых частота пластомных мутаций в сотни и даже тысячи раз превышает спонтанный уровень Причина: рецессивные ядерные гены, названные генами-мутаторами

a- Petunia Гены-мутаторы хлоропластной ДНК у разных видов Pm plastid mutator (Oenothera) chm chloroplast mutator (Arabidopsis) iojap и mutator ( Zea)

Возникшие пластидные мутации далее наследуются по материнскому типу и уже не зависят от генотипа ядра В гомозиготном состоянии гены-мутаторы вызывают дестабилизацию хлоропластного генома Мутабильность ядерных генов у растений - носителей генов-мутаторов не повышается ядро

Очевидно, происходит нарушение какого-то компонента системы репликации - репарации пластид, кодируемого ядром Механизм действия генов-мутаторов окончательно не выяснен

Ген chm арабидопсиса, вызывает наследственные изменения не только в пластидах (пестролистность) но и в митохондриях Наблюдаемые аномальные митохондриальные фрагменты предсуществовали у растений дикого типа, а гены-мутаторы способствовали их амплификации и вытеснению нормальных молекул Предположение:

Мутации хлоропластных ДНК при культивировании тканей in vitro Культура пыльников растений широко используется для получения гаплоидных растений Но у злаков – регенерантов из пыльников очень большая доля альбиносных растений в культуре ( иногда до %) Хлоропластная ДНК таких альбиносов имеет огромные делеции, иногда до 80% всей молекулы Условия культивирования каким-то непонятным пока образом провоцируют эти мутации, почему-то именно у злаков

Мутации ДНК хлоропластов и митохондрий претерпевают особенно долгий путь сегрегации, последовательно органеллы целого организма клетки на уровне: Многие возникающие мутации элиминируются на этом пути

На сегодня хватит