Проблемы пострадиационного восстановления : вчера и сегодня

В 1958 г. Владимир Иванович Корогодин обнаружил явление пострадиационного восстановления клеток дрожжей в непитательной среде. Такое восстановление осуществляется медленно (в течении час) и зависит от плоидности клеток (проявляется у диплоидных и отсутствует у G1-гаплоидных клеток), что указывает на участие в этом процессе гомологичной рекомбинации. Система пострадиационного восстановления в непитательно среде представляет уникальные возможности для молекулярно генетического анализа рекомбинационных процессов в их кинетике без вмешательства репликации ДНК.

Профили седиментации ДНК из клеток Saccharomyces cerevisiae в градиенте концентраций нейтральной15-30% сахарозы (Luchnik, Glaser and Shestakov, 1977) Необлученный контроль Облучение в дозе 1000 Gy Облучение в дозе + выдерживание в непитательной среде, 48 часов.

Выживаемость облученных рентгеновскими лучами клеток диплоидного и гаплоидного штаммов S. cerevisiae до и после выдерживания в непитательной среде ШтаммОблучение (Gy) Выдерживание в непитательной среде, ч Выживаемость, % Диплоид ,6 6,0 27,5 Гаплоид ,1 0,03 0,01

Схема репарации двунитевых разрывов ДНК по механизму «разрыв и копирование» (break-induced replication, BIR) (Luchnik, Glaser, Shestakov, 1977; Voelkel-Meiman and Roeder, 1990; Malkova, Ivanov and Haber, 1996; Morrow, Connelly and Hieter, 1997)

Два пути репарации ДНР ДНК в условиях инкубации в непитательной среде: быстрая и медленная.

Профили седиментации ДНК из клеток Saccharomyces cerevisiae в градиенте концентрации нейтральной 15-30% сахарозы. Протопласты получали стандартным методом (А) и в присутствии 10 % KCl (В) (Glasunov, Glaser and Kapultsevich, 1989) ДНК из необлученных клеток Облучение в дозе 570 Gy, лизис клеток сразу после облучения Облучение в дозе 570 Gy, лизис клеток после выдерживания в непитательной среде при 28 0 С в течение 1 ч.

Рекомбинантные структруры ДНК, выделенные из Х-облученных диплоидных G1-клеток Saccharomyces сerevisiae. Клетки инкубировали в непитательной среде в течении 2-4 часов (Глазер, Самадашвили и Гаузе, 1982)

Белки, кодируемые генами эпистатической группы RAD52, и их основные функции. Rad50, Mre11, Xrs2 – формирование и процессинг ДНР ДНК. Rad51 – ключевой белок рекомбинации, осуществляет формирование нуклеопротеинового филамента, синапсис и обмен цепями между рекомбинирующими ДНК. Rad52 – связывается с однонитевой ДНК и обеспечивает формирование Rad51-ДНК-филамента. Rad53 – белок check-point контроля клеточного цикла, осуществляет задержку клеточного цикла в случае повреждения ДНК и обеспечивает время необходимое для репарации ДНР до вступления в следующую фазу цикла ДНК. Rad54 и его паралог Rdh 54 – участвуют в изменении структуры хроматина, стимулируют обмен цепями, осуществляемый Rad51. Rad55, Rad57 – паралоги Rad51, функционируют в виде гетеродимера, стабилизируют Rad51-ДНК-филамент. Rad59 – связывается с однонитевой ДНК, функционально перекрывается с Rad52.

Модель рекомбинации на основе репарации двунитевых разрывов ДНК (Szostak, Orr-Weaver, Rothstein and Stahl, 1983)

Схема репарации двунитевых разрывов путем зависимого от репликации отжига цепей ДНК (synthesis-dependent strand annealing, SDSA) (Nassif, Penney, Pal, Engels and Gloor, 1994; Ferguson and Holloman, 1996; Paques and Haber, 1999)

Репарация двунитевых разрывов (ДНР) ДНК путем non-homologous end-joining (NHEJ) DNA-PKCS – каталитическая субъединица ДНК-зависимой протеинкиназы;NBS1 – Nijmegen breakage syndrome I;MRE11 – meiotic recombination 11;XRCC4 – X-ray- repair-cross-complementing defective repair in Chinese hamster mutant 4.ДНК-лигаза IV XRCC4ЛигированиеRAD50MRE11NBS1Процессинг концовDNA-PKCSГетеродимер KU80/KU70Репарация двунитевых разрывов (ДНР) ДНК путем non-homologous end-joining (NHEJ) DNA-PK CS Гетеродимер KU80/KU70 Процессинг концов NBS1 MRE11 RAD50 Лигирование ДНК-лигаза IV XRCC4