Мутантные формы люциферазы светляков с пониженной pH-чувствительностью спектров биолюминесценции Михаил Кокшаров, Наталья Угарова Кафедра химической энзимологии Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова Работа выполнена при поддержке РФФИ, грант а
Биолюминесцентная реакция, катализируемая люциферазами светляков h max = нм max = нм
Применения люциферазы светляков биолюминесцентная АТФ-метрия для определения бактериальных загрязнений различных объектов ген-маркер экспрессии при изучении внутриклеточных процессов пиросеквенирование изучение белок-белковых взаимодействий биолюминесцентная метка
Для спектров биолюминесценции большинства нативных люцифераз светляков характерны сильные изменения в зависимости от значения pH раствора, температуры и т.д. Бимодальный спектр при промежуточных условиях
1-191 АМК люциферазы (субдомен A) Участок гена люциферазы светляков Luciola mingrelica, кодирующий первые 225 остатков, подвергали случайному мутагенезу C-домен N-домен
pH-чувствительный спектр люциферазы дикого типа (WT) Жёлто-оранжевое свечение колоний E. coli при пониженном внутри- клеточном pH в отличие от жёлто-зеленого in vitro при pH~8 in vitro Биолюминесцеция люциферазы L. mingrelica дикого типа ( WT ) в колониях E. coli Tris-буфер pH 7.8 in vivo (в E. coli)
Биолюминесценция колоний E. coli, экспрессирующих люциферазу дикого типа и мутанты
Изменение спектральных свойств мутантов Спектр практически не зависит от pH Спектр слабо зависит от pH Увеличение доли «красного» излучателя Y35N Y35H F16L+A40S F16LA217T
Также замены Y35N, Y35H значительно уменьшают влияние повышенной температуры на спектр биолюминесценции Люцифераза дикого типа Мутанты Y35N, Y35H
Расположение ключевых мутаций, понижающих pH-чувствительность спектра биолюминесценции L. cruciata crystal structure: Nakatsu et al, 2006 F16 Y35 A40 C-домен группа люциферина в канале связывания
Расположение ключевых мутаций, понижающих pH-чувствительность спектра биолюминесценции L. cruciata crystal structure: Nakatsu et al, 2006
Сравнение остатков в 16, 35 и 40 положениях у различных групп люцифераз Из щелкунов Из светляков
Спасибо за внимание!
Свойства изученных мутантов
Мутант Замены АМК, в порядке предположительного влияния на спектр WT MT8S118C MT2 F16L I19T MT3 Y35N MT4 Y35H K191R MT6A40SF16LY11FS118C MT5A217TS222TS118C Биолюминесценция колоний E. coli Мутанты, отобранные для изучения