1

2 Три транскрипта: 1)C HSP1 – в D-loop 2)C HSP2 – upstream 5-конца 12 S rRNA (частота инициации в 20 раз ) 3)С LSP – в D-loop Транскрипция PMID:

3 POLRMT TFAM (h-mtTFA – transcription factor A) TFBM1 (h-mtTFB1) TFBM2 (h-mtTFB2) - образует гетеродимер с POLRMT MTERF1 (mitochondrial termination factor) – терминирует транскрипцию PMID: В транскрипции участвуют: TFEM (transcriptional elongation factor mitochondrial) - процессивность POLRMT

4 PMID: РНК-полимераза POLRMT Способна осуществлять транскрипцию только в присутствии TFAM и одного из транскрипционных факторов: TFBM1 или TFBM2

5 TFAM – регулирует число копий мтДНК и участвует в регуляции транскрипции. TFBM1 (h-mtTFB1) и TFBM2 (h- mtTFB2) имеют сходство с рРНК- метилтрансферазами, которые диметилируют аденозин около 3- конца 12S pРНК. Эта модификация консервативна для про- и эукариот, за исключением дрожжей. Филогенетический анализ показал, что они происходят от рРНК метилтрансферазы эндосимбионта. TFBM1 и TFBM2 способны связывать РНК или оцДНК. PMID: TFAM

6 PMID: TFB1M и TFB2M диметилируют А 936 и А937 в 12S rRNA Отсутствие TFB1M: приводит к потере диметилирования снижает уровень 12S rRNA ведет к невозможности трансляции в митохондриях.

7 TFB M1 имеет 2 функции: Участвует в транскрипции (не ясно как именно) рРНК-метилтрансфераза (MT) Мутации в МТ-мотиве не приводят к отсутствию транскрипции in vitro. Нокдаун TFB M1с помощью iRNA у дрозофилы не меняет число транскриптов, но синтез белка в митохондриях => TFB M1 участвует в трансляции TFB M1 играет роль транскрипционного фактора в неких специфических условиях или при транскрипции только определенных мРНК.

8 TFBM2: рРНК-метилтрансферазная активность менее выражена Специализированный транскрипционный фактор: нокдаун с помощью iRNA у дрозофилы число транскриптов в 2-8 раз. Возможны 2 функции: Связывает оцДНК, стабилизируя область промотора в частично расплетенном состоянии во время инициации транскрипции Связывает новую цепь РНК, предотвращая образование ДНК-РНК гибридов, способных ингибировать промотор.

9 1.TFBM1 (h-mtTFB1) и TFBM2 (h-mtTFB2) – рРНК- метилтрансферазы, диметилирующие аденозин около 3-конца 12S pРНК 2.TFBM1 и TFBM2 являются транскрипционными факторами, POLRMT может осуществлять транскрипцию только в комплексе с одним из них 3.Нокдаун TFBM1 не влияет на транскрипцию, но существенно снижает уровень трансляции 4.Нокдаун TFBM2 снижает уровень транскрипции. 5.Основная функция TFBM1 – метилирование 12S pРНК и регуляция трансляции 6.Основная функция TFBM2 – участие в транскрипции

10 TFAM высоко консервативен: 77% гомологии у человека и мыши У человека состоит из 246 ак, 25 кДа 23% составляют + аминокислоты. TFAM – регулирует число копий мтДНК и участвует в регуляции транскрипции. PMID:

11 Доменная структура TFAM: Mitochondrial Targeting Sequence (MTS) HMG (High mobility group) box I linker HMG box 2 C-terminal tail - нет гомологии ни с одной из известных последовательностей PMID:

12 TFAM (transcription factor A). HMG (High mobility group) box: 3 спирали и 2 петли, формирующих L-структуру. Она связывается с малым желобком ДНК, изгибая ее. PMID:

13 TFAM – транскрипционный фактор, стимулирующий активность POLRMT на двух промоторах: LSP и HSP1, связывается с ДНК upstream от промотора. Его уровень направленно регулирует транскрипцию комплексами TFBM1/POLRMT и TFBM2/POLRMT in vitro.

14 Связывание TFAM с ДНК: TFAM способен связываться как со специфичными промоторными последовательностями, так и с неспецифическими последовательностями ДНК. В низких концентрациях TFAM лучше связывается с промоторами LSP и HSP1, чем с неспецифической ДНК, и с LSP лучше, чем с HSP1. Разница нивелируется делецией С-конца. PMID: Изгибает ДНК промоторов одинаково, и лучше, чем неспецифическую ДНК, изгиб зависит от наличия С-конца. С LSP связывается сильнее. При низких концентрациях TFAM активирует LSP, по мере возрастания концентрации включает и HSP1.

15 PMID: Мутанты TFAM (не в С-конце), которые связываются с LSP, но слабо сгибают ДНК, сильно снижают транскрипцию с LSP => TFAM должен изогнуть ДНК в области промотора для начала транскрипции.

16 Кооперативность связывания TFAM: Одна молекула TFAM стимулирует присоединение следующей, при этом меняется локальная структура ДНК. Для этого важен С-конец. PMID:

17 Мультимеризация TFAM: Способен к гомодимеризации. Данные противоречивы: мономер или димер? Взаимодействует с промоторами и с неспецифической ДНК в форме димера, при наличии С-хвоста. При кристаллизации связан с LSP в форме мономера. PMID:

18 TFAM упаковывает мтДНК в нуклеоидах: При соотношения TFAM:ДНК доступность ДНК для ферментов и транскрипционных факторов: ДНК метилтрансфераза снижает доступ к ДНК при гиперэкспрессии TFAM, соотношения TFAM:ДНК ингибирует транскрипцию. Уровень TFAM регулирует состояние нуклеоида: Репликация ДНК идет при низкой концентрации Экспрессия (транскрипция+трансляция) происходит при среднем уровне TFAM «Молчащий» геном наблюдается при высоком уровне PMID:

19 Регулирование числа копий мтДНК TFAMом Существует 2 гипотезы: 1.Высокая частота связывания TFAM с LSP увеличивает инициацию репликации. POLRMT создает на LSP затравки для репликации. TFAM стимулирует транскрипцию с LSP в меньшей концентрации, чем нужна для активации HSP1. Количество TFAM на 1 копию мтДНК: 50 молекул в клетках HeLa 35 молекул в HEK 293 LSP при этом занят на 85%, HSP1 – на 35%.

20 2. Неспецифическое связывание TFAM по всему геному стабилизирует количество копий мтДНК При гиперэкспрессии TFAM с делецией С-конца в клетках с нокдауном эндогенного TFAM уменьшается активация транскрипции, но увеличивается число копий мтДНК. Количество TFAM на 1 копию мтДНК: молекул => TFAM может быть связан с мтДНК по всей длине через каждые нуклеотидов. Связывание TFAM с ДНК – динамичный процесс: TFAM способен полностью блокировать ДНК, но в то же время его связь с ДНК лабильна и обеспечивает регуляцию транскрипции. TFAM уничтожается протеазой Lon. Известны посттрансляционные модификации: гликозилирование, фосфорилирование, ацетилирование и убиквитинилирование.

21 Basal transcriptional activity - no TFAM PMID:

22 Протеаза Lon регулирует соотношение TFAM:ДНК в митохондриях: Нокдаун Lon увеличивает уровень TFAM и число копий мтДНК Гиперэкспрессия Lon снижает уровень TFAM и количество мтДНК Фосфорилирование и протеолиз – основные пути регуляции работы TFAM PMID:

23 TFAM фосфорилируется внутри HMG box 1 (HMG1) cAMP- зависимой протеинкиназой PKA. Это фосфорилирование ухудшает способность TFAM связывать ДНК и активировать транскрипцию. Только свободный от ДНК TFAM (DNA-free TFAM) уничтожается протеазой Lon. Фосфорилирование и протеолиз – основные пути регуляции работы TFAM. PMID:

24 1. TFAM связывается с ДНК как неспецифически, так и со специфичными промоторными последовательностями 2. При связывании с TFAM ДНК изгибается 3. TFAM – транскрипционный фактор, стимулирующий активность POLRMT на промоторах HSP1 и LSP 4. При низких концентрациях TFAM активирует LSP, по мере возрастания его концентрации включается HSP1 5. TFAM должен изогнуть ДНК в области промотора для начала транскрипции 6. Уровень TFAM регулирует состояние мт ДНК в нуклеоиде: репликация идет при его низкой концентрации, экспрессия генов происходит при среднем уровне TFAM, «молчащий» геном наблюдается при его высоком уровне 7. Фосфорилирование и протеолиз – основные пути регуляции работы TFAM

25 Транскрипт Н1 терминируется внутри tRNA Leu Транскрипт Н2 - точное место терминации неизвестно Транскрипт L - точное место терминации неизвестно Терминация транскрипции осуществляется mTERF1. Терминация транскрипции PMID:

26 Между двумя соседними спиралями расположены гидрофобные ак (D). PMID: MTERF1 (mitochondrial termination factor) – белок 39 кДа содержит 8 Mterf мотивов и дополнительный искаженный С- концевой мотив

27 MTERF связывается вдоль большой бороздки ДНК. Это приводит к изгибу ДНК на 25 о. Затем концы ДНК вновь принимают В-конформацию, а центральная часть молекулы расплетается. Три нуклеотида – А на L-цепи и С и Т на Н-цепи «выворачиваются» из дцДНК, они стабилизируются в таком состоянии тремя ак MTERF1: R162, F234, Y288. PMID:

28 «Вывернутые» нуклеотиды стабилизированы дополнительно Н-связями с азотистыми основаниями и фосфатными группами. Мутантный MTERF1 (по R162, F234, Y288) связывается с ДНК (В), но «вывернутые» нуклеотиды нечем стабилизировать => только 1 нуклеотид – С остается вне цепи, хотя и в другой конформации. Из трех аминокислот R162, F234, Y288, только R162 консервативен => у других видов механизм связывания MTERF1 с ДНК может быть другим. PMID:

29 MTERF1 связывается с ДНК неспецифично: за счет электростатических взаимодействий между фосфатными группами и положительно заряженной поверхностью белка. За счет чего происходит специфичное связывание с сайтом терминации?

30 MTERF1 связывается с ДНК неспецифично, но «вывертывание» 3х нуклеотидов происходит только в результате узнавания специфической последовательности. Мутантный MTERF1 (по R162, F234, Y288) связывается с сайтом терминации хуже wtMTERF1, и примерно с такой же аффинностью как wtMTERF1 связывает неспецифичную дцДНК => «вывертывание» нуклеотидов – результат специфичности связывания. Вывертывание нуклеотидов не определяет специфичность, а только стабилизирует связывание.

31 Специфичность определяется Н-связями 5ти Arg MTERF1 с большим желобком ДНК. И Arg, и нуклеотиды, с которыми они взаимодействуют, консервативны в MTERF1 и мтДНК соответственно. В других MTERF Arg не консервативны.

32 MTERF1 способен связываться с неспецифической последовательностью ДНК. Но «вывертывание» нуклеотидов, способствующее высокой аффиности связывания, происходит только при узнавании специфической последовательности – сайта терминации. PMID:

33 Предложена модель: связывание с MTERF1 приводит к образованию петли между этим сайтом в HSP1 и каноническим сайтом терминации в конце гена 16S рРНК. Эта петля позволяет POLRMT и другим транскрипционными факторам вновь связываться с HSP1, инициируя транскрипцию. PMID: MTERF1 способен инициировать транскрипцию in vitro Дополнительный сайт терминации найден в HSP1, он важен для инициации транскрипции in vitro Есть предположение, что MTERF1 может участвовать в инициации транскрипции с HSP2.

34 In vitro терминация в тРНК Leu с помощью MTERF1 двунаправлена: т.е. терминируется синтез транскриптов Н1 и L. Но терминация транскрипта с LSP гораздо более эффективна. Терминация транскрипта Н2 происходит upstream тРНК Phe. Сайт терминации не определен. Известны 2 белка, которые связываются с этим участком. PMID:

35 Механизм терминации транскрипции MTERF1 напоминает механизм терминации репликации у E.coli PMID: Фактор терминации Tus связывается с ДНК также выворачивая основания.

36 Это напоминает механизм терминации транскрипции бактериофага Т7: РНК образует тРНК- подобную структуру, полимераза имеет низкое сродство к дцНК. Терминация транскрипции при синтезе праймеров для транскрипции POLRMT происходит за счет образования G-квадруплекса на РНК Вероятно, такой механизм может использоваться и при терминации транскрипции с HSP2. Не исключено, что MTERF1 тоже как-то участвует в этом процессе.

37 Структура G-квадруплекса

38 Мутации в сайте связывания MTERF1 вызывают серьезные митохондриальные заболевания Замена A3243G присутствует в 80% случаев MELAS (Mitochondrial Encephalomyopathy, Lactic Acidosis, Strokelike Episodes). Такая замена несильно влияет на уровень транскрипции с HSP, но нарушает структуру тРНК Leu. По терминации LSP данных нет. Замена G3249G синдром Kearns-Sayre Замена G3242A – неохарактеризованная митохондриальная патология

39 1.MTERF1 связывается с ДНК неспецифично 2.MTERF1 связывается с сайтом терминации с большей аффиностью, чем с неспецифической последовательностью ДНК за счет «вывертывания» нуклеотидов 3.Специфичность связывания MTERF1 с сайтом терминации определяется взаимодействием 5ти остатков Arg с несколькими консервативными нуклеотидами 4.MTERF1 способен инициировать транскрипцию in vitro 5.Мутации в сайте терминации транскрипции вызывают серьезные митохондриальные заболевания

40 Другие белки семейства MTERF MTERF1 и MTERF2 уникальны для Позвоночных MTERF3 и MTERF4 есть не только у Позвоночных, но и у Беспозвоночных животных (червей и насекомых) MTERF1-3 участвуют в транскрипции, а MTERF4 участвует в трансляции.

41 MTERF2 гиперэкспрессия ингибирует рост клеток связывается с ДНК неспецифически и присутствует в нуклеоидах Нокаут в мыши: дефекты в дыхательной цепи при переходе с высокоуглеводной на низкоуглеводную диету: уровня большинства мРНК и тРНК и трансляции некоторых белков. На стандартной диете – нормальный уровень всех РНК, кроме тРНК ближних к промотору и тРНК дальних от промотора => MTERF2 позитивный регулятор транскрипции. Нокаукт также число копий мтДНК => MTERF2 может быть регулятором репликации

42 структура похожа на MTERF1. Но в MTERF3 есть только 1 Arg из пяти, необходимых для специфичного связывания с ДНК и только одна из трех аминокислот, необходимых для стабилизации вывернутых оснований. Нокаут в мыши: летален у эмбрионов, т.к. сильно изменен уровень транскрипции и соотношение разных транскриптов. MTERF3 регулятор транскрипции. PMID: MTERF3

43 Важен для эмбрионального развития мыши. Нокаут приводит к изменению уровня транскрипции, а также к ослаблению трансляции и дефектам в сборке рибосом. Связывает 16S рРНК и формирует комплекс с мт рРНК метилтрансферазой, необходимый для вставки 16S рРНК в большую субъединицу рибосом. Возможно, осуществляет направленную связь между транскрипцией и трансляцией. MTERF4 PMID:

44 POLRMT- РНК-полимераза, проводит транскрипцию и синтезирует праймеры для ДНК-полимеразы TFAM (h-mtTFA –transcription factor A) – регулирует число копий мтДНК и участвует в регуляции транскрипции. TFBM1 (h-mtTFB1) – рРНК-метилтрансфераза (MT), участвует в регуляции трансляции, транскрипционный фактор TFBM2 (h-mtTFB2) – транскрипционный фактор, образует гетеродимер с POLRMT, рРНК-метилтрансфераза (MT) TFEM (transcriptional elongation factor mitochondrial) - процессивность POLRMT MTERF1 (mitochondrial termination factor) – терминатор транскрипции PMID: