1 Физика и структурная биология в начале XXI века И. Н. Сердюк Лаборатория физики нуклеопротеидов, Институт Белка РАН, г. Пущино. и Лаборатория нейтронной физики, Объединенный Институт Ядерных Исследований, г. Дубна 22 Февраля, 2005

2 Транскрипция Поток информации ДНК м-РНК Рибосома Общая схема биосинтеза белка Поток строительного материала Трансляция Цитоплазма Ядро т-РНК Белок Хромосома, нуклеосома, ДНК Факторы транскрипции Матричная РНК Рибосома, т-РНК, аминокислоты Факторы трансляции Разнообразные белки Линейные и вращательные молекулярные моторы Схематическое изображение клетки Е.Coli. Цитоплазма Ядро Мембрана Мотор Амино кислота

3 Двойная спираль ДНК (Дж. Уотсон и Ф. Крик, 1953) Репликация двойной спирали ДНК приводит к образованию двух гибридных молекул, состоящих из родительской и дочерней цепи. Обе гибридные молекулы идентичны друг другу и полностью повторяют исходную цепь. Схематическое изображение двойной спирали (слева) и структуры «бок о бок» (справа). Обратите внимание, что общие размеры (c- шаг спирали и 2а- диаметр спирали) в обоих случаях одинаковы. A T Г Ц А Т Ц Г Упорядоченные волокна ДНК

4 Рентгеновская структура гемоглобина (М. Перутц и Дж. Кендрю, 1957) Молекула гемоглобина состоит из двух -цепей и двух -цепей. Каждая глобиновая цепь состоит из 8 спиралей, связанных короткими перемычками и образующих карман, в котором помещается группа гема. Гемы β-цепь α-цепь

5 Первое революционное событие в структурной молекулярной биологии 1.Появление синхротронных источников 2.Появление быстродействующих рентгеновских детекторов 3.Девиз: «NCNG 30S 2.7 Å

6 Ондулятор Отклоняющий магнит Синхротронные источники третьего поколения Синхротро н Большое число отклоняющих магнитов располагаются по окружности синхротронного кольца. Они удерживают пучок электронов на круговой орбите. Ондуляторы располагаются между магнитами. Они содержат большое число магнитных полюсов, позволяющих сформировать хорошо сфокусированный узкий пучок (расходимость около градуса).Кроме того они позволяют существенно увеличить яркость пучка и его когерентность. Экспериментальные установки ESRF в Гренобле (Франция)- самый мощный синхротронный источник в мире (Ø кольца ~300 м).

7 Нейтронные источники Стационарные (с тратой энергии)Импульсные (с накачкой энергии) Ускоритель электронов + мишень из тяжелого металла Orela Окридж, США ( н/см2сек) Ускоритель протонов + мишень из тяжелого металла ISIS, Англия ( н/см 2 сек) SINQ, Швейцария ( н/см 2 сек) Мигающие (с тратой энергии) Активная зона с подвижным отражателем ИБР-2, Россия н/см2сек Обогащенный уран U-235 HFR (60 MW) Гренобль,Франция н/см 2 сек Обогащенный уран U-235 PIK (100 MW) Гатчина, Россия н/см 2 сек

8 Трехмерная структура молекулы лизоцима и 157 молекул связанной с ним воды с разрешением 2 Å. Такое разрешение эквивалентно 0.9 Å рентгеновскому. 696 атомов водорода и 264 атомов дейтерия показаны небольшими сиреневыми и зелеными сферами, соответственно. Атомы кислорода и углерода показаны большими красными и зелеными сферами, соответственно. Нейтронная белковая кристаллография: лизоцим

9 Импульсная Фурье-ЯМР спектроскопия, многомерный и гетероядерный ЯМР, изощренные схемы селективного мечения белков и нуклеиновых кислот 2 H, 13 C, 15 N, расширение рабочей частоты ЯМР до 1 ГГz - все эти инновации привели к тому, что сегодня ¼ всех биологических структур с высоким пространственным разрешением получается методом ЯМР. 1D и 2D ЯМР спектры небольшого белка, протеазного ингибитора K (57 аминокислот) в 0.01 M, pD 3.4, 25 o C, 360 MHz. 1D 1 H спектр Этажерочное представление COSY спектра Контурное представление COSY спектра. Третья координата - интенсивность.

10 Методы рентгеновской кристаллографии и ЯМР обладают двумя принципиальными недостатками: 1) работают при очень высокие концентрациях вещества (число молекул в образце составляет ) 2) не позволяют видеть, как функционируют биологические молекулы в реальном режиме времени 3) не позволяют видеть, как функционирует одна биологическая молекула. Новые физические подходы, Принципиальный переход от исследования макромолекул в больших объемах (доли миллилитра) к исследованию макромолекул в предельно малых объемах (доли аттолитра). Уникальная возможность перейти от описания свойств макромолекул в ансамбле к описанию их свойств на одиночном уровне. «Мы никогда не сможем работать с одиночными электронами, атомами и молекулами» (Эрвин Шредингер, 1952)

11 Исследование структуры и функционирования одиночных биологических макромолекул Детектирование одиночных флюоресцентно меченых молекул с помощью лазерной флюоресценции в предельно малых объемах (аттолитры) Конфокальная микроскопия Микроскопия ближнего поля Визуализация одиночных макромолекул Микроскопия силового поля Манипулирование одиночными биологическими макромолекулами (растягивание модулярных белков и РНК, скручивание, растягивание, расcтегивание, разгрызание одиночных двойных спиралей ДНК, сборка и разборка нуклеосом Микроскопия силового поля Оптические и магнитные ловушки Визуализация и описание работы линейных и роторных биологических моторов в терминах сил (пиконьютоны) и расстояний (нанометры), сопровождающих каждую фазу их рабочего цикла 1 attoliter= L, 1 piconewton = N, 1 nanometer = m

12 Лазерная наведенная флюоресценция, В лазерной наведенной флюоресценции одиночная молекула периодически возбуждается с тем чтобы дать максимальное число фотонов за время эксперимента. Диаграмма поглощения и испускания цвета в явлении флюоресценции

13 Флюоресцентные метки, используемые в структурной биологии Внутренние метки: триптофан и тирозин в белках, а также минорные основания в т-РНК Внешние метки: dansyl chloride, 8-anilino-1- naphthalen sulfonat, 1, etidium bromide, iodacetamide, maleimide, and много других Зеленый флюоресцентный белок из медузы Aequorea victoria Вторичная структура зеленого флюоресцентного белка из медузы. Хромофор (p-hydroxybenzylideneimidazolidinone) Green-FP, Cyan-FP, Yellow-FP, Кристаллическая структура зеленого белка с последовательностью Thr65-Tyr66-Gly67 и его мутантов. Структура напоминает плетеную корзину из 11 спиралей длиной 42Å и диаметром 24Å

14 Флюоресцентный перенос энергии. Флюоресцентная линейка В флюоресцентном переносе энергии (FRET), флюорофор, называемый донором (D), переносит часть энергии на флюорофор, называемый акцептором. (А). Такой перенос энергии возможен только в том случае, если спектр эмиссии донора перекрывается со спектром поглощения акцептора и. флюорофор (А) находится на определенном расстоянии от флюорофора (D) FRET позволяет измерить расстояние между донором и акцептором, поскольку перенос энергии E Т очень сильно расстояния между флюорофорами где R 0 (nm), есть расстояние на котором 50% перенос энергии имеет место. (F3.5)

15 GFP как клеточный репортер Двухцветная флюоресцентная фотография клетки выявляющая распределение двух белков (Yellow-FP и Cyan-FP) в разных ее компартментах. Каждый из GFP-белков присоединен к определенному исследуемому белку. GFP как диагностик взаимодействия белков с лигандами Принципиальная схема опыта, в которой GFP используется как конформационный индикатор взаимодействия белков с лигандами. После связывания белка с лигандом измеряется перенос энергии между донором (GFP) и акцептором (Cy3). Перенос энергии очень чувствителен к расстоянию донор-акцептор.

16 Визуализация одиночных молекул требует радикального изменения наблюдаемого обьема вплоть до нескольких аттолитров 1)Двухфотонное возбуждение в лазерной наведенной флюоресценции 2)Микроскопия ближнего поля 3)Флюоресцентная микроскопия в режиме полного внутреннего отражения 4)Конфокальная микроскопия

17 Двухфотонное возбуждение In 1931 M. Goppert-Mayer gave theoretical background of two-photon excitation in fluorescence. Предельно малый обьем

18 Микроскопия ближнего поля Near-field scanning optical microscopy (NSOM). Безлинзовая микроскопия Техника изображения основанная на принципе «оптического стетоскопа», помещающегося на максимально коротком расстоянии от образца (меньше длины волны). Изображение получается сканированием стетоскопа вдоль образца. Пространственное изображение ограничено диаметром светового сопла. Одиночные молекулы сульфородамина на стеклянной поверхности. Диаметр 700 Å Оптическое волокно Одиночная молекула

19 Флюоресцентная микроскопия при полном внутреннем отражении Характерная глубина проникновения света около 3000Å Характерный обьем возбуждения ~ 20 attoлитров 3000 Å Падающий лазерный луч Кварц Раствор Затухающая стоячая волна

20 Конфокальная микроскопия Формирование линзой изображения двух точек тонкого образца в отсутствии диафрагмы. Демонстрация получения конфокального изображения. Три точки: клетка 1, точечная диафрагма и источник света взаимно конфокальны Формирование линзой изображения тонкого образца в присутствии точечной диафрагмы.

21 Method of optical detectionExcitation volumeSignal-to- noise Spatial resolution Mode of detection 1. Near field optical microscopyFemtoliters (5x L) High nmPoint 2. Far-field confocal microscopySubfemtoliters (~5x L) HighDiffraction limit Point 3. Far-field microscopy in flow streamPicoliters (~5x L) HighDiffraction limit Point 4. Wide-field epi-illuminationFemtoliters (5x L) ReducedDiffraction limit Parallel 5. Wide-field epi-illumination with total internal reflection excitation. Attoliters (20 x L) HighDiffraction limit Parallel The main characteristic of five methods of single molecules optical detection.

22 П Е Р Е Р Ы В? Визуализация и манипулирование одиночными макромолекулами

23 Сканирующая туннельная микроскопия (G. Binning and H. Rohrer, 1980) Iodine atoms on the surface of platinum crystalA Liquid crystal (8CB) on graphite. Benzene rings are revealed. Strands Z-DNA laying on graphite Вакансия Бензольное кольцо ДНК?

24 Микроскопия силового поля (безлинзовая микроскопия) Микроскопия силового поля (по английски AFM), не содержит линзы как таковой для формирования изображения. Она использует острие атомных размеров на конце длинной гибкого удилища. Острие сканирует поверхность молекулы. Работа острия напоминает работу палочки слепого. Наноцилиндр из C60 «Сердце» микроскопа – гибкое удилище Остриеатомных размеров Контактная мода Осциллирующая мода 200 нм

25 Изображение биологических макромолекул методом AFM Слева: изображение иммуноглобулина G методом AFM. Справа: кристаллическая структура Три последовательных изображения ( 0, 12 и 24 минуты) показывают разрезание ДНК рестрикционной нуклеазой Bal 31.

26 Изображение биологических структур методом AFM ДНК Фальш Кольцевая ДНК в B-форме. Диаметр спирали 24 Å

27 Наблюдение за ростом двумерных кристаллов методом AFM Рост кристаллов белка аннексина V на подложке из планарных липидных бислоев. Прямая визуализация дефектов в кристаллах аннексина 19 мин.23 мин26 мин 29 мин31 мин34 мин

28 Манипуляция одиночными макромолекулами Бусинка с высоким показателем преломления преломления располагается в центре интенсивного лазерного пучка. Типичное видео изображение магнитной бусинки (Ø 2.9 микрон) и микропипетки в оптическом микроскопе. В типичном эксперименте острие укосины вдавлива- ется в слой белка, привязан- ного к золотой подложке. Затем подложка опускается вниз под действием пьезо- электрической силы.

29 В оптическом твизере сильно сфокусированный лазерный луч является оптической ловушкой, которая втягивает в фокус маленькие коллоидальные частицы. Радиационное давление несколько смещает частицу вдоль оптической оси. Оптический твизер

30 Метод AFM методе в режиме измерения силы. Типичный эксперимент по растягиванию одиночной молекулы в методе AFM «Полибелок» состоит из множественных копий белка.

31 Белковая архитектура и механическая стабильность Красные линии указывают топологию критических H-связей, разрывающихся при приложении силы. Human cardiac titin immunoglobulin 204 ± 26 pN 60 ± 20 pN Single C2 domain Rat calmodulin (CaM4 ) 20 ± 20 pN

32 Природные конфигурации ДНК «Искусственные» конфигурации ДНК (Cлева S-DNA), полученная растяжением B-DNA с помощью оптического твизера (диаметр на 30% меньше исходной) (Cправа P-DNA), полученная скручиванием B-DNA с помощью магнитного твизера. Примечательно, что в такой ДНК основания смотрят наружу. BSBS Растягивание ДНКСкручивание ДНК BPBP Величина силы для перехода ДНК из В- в P- форму ~ 20 pN Величина сила для перехода ДНК из B- в S- форму ~ 65 pN

33 Схематические диаграммы использования оптических твизеров при исследовании линейных молекулярных моторов

34 РНК-полимераза- вдоль ДНК Кинезин- вдоль микротрубочек Миозин - вдоль актиновых нитей Все линейные моторы движутся вдоль полимерных субстратов за счет энергии АТФ. Скорость работы 200 нуклeотидов/сек

35 Сравнение основных механических характеристик молекулярных моторов. Moтор/рельсыРазмер шага Maксим. усилие Maксим. эффектив- ность (КПД) Processivity (сцепляемость ) Moда движения Mиозин/актинПеремен- ный (5.5nm×n) 3-6 pN~20%плохаяпрыжки Kинезин/Mикротрубочка8 nm5 pN~50%хорошаягуляние РНК-полимераза/ДНК0.34 nm14-27 pN~20%прекраснаяползание Размер шага каждого линейного мотора зависит типа платформы: Реальная величина шага передвигающегося миозина скорее всего ожидается с кратностью 5.5 нм, которое соответствует расстоянию между мономерами актина. РНК- полимераза движется с шагом 0.34 нм, которое соответствует шагу спирали ДНК. Кинезин движется с шагом 8 nm, что соответствует расстоянию между отдельными белками микротрубочки.

36 F 0 F 1 ATP фазный мотор двойного действия Молекулярная архитектура Na-насоса F 0 мотора, генерирующего АТФ. Экспериментальная схема прямого наблюдения вращения F 1 мотора. Мотор вращается со скоростью 4 оборотов/сек и шагом 120 о. Рентгеновская структура комплекса с разрешением около 2.2 Å Мембрана митохондрии F0F0 F1F1 F0F0 F1F1

37 Молекулярная архитектура бактериальной флагеллы как вращающегося устройства Бактериальная флагелла состоит из мотора, располагающегося внутри клетки, втулки с различными уплотняющими манжетами в мембране, крюка и пропеллера длиной 10 μm, располагающегося вне клетки (на рисунке не показан). В клетке E. Coli пропеллер вращается со скоростью оборотов в минуту и двигает клетку со скоростью 30 μм/сек. Мотор Крюк Втулка Мембрана Ядро Цитоплазма Ротор, статор, уплотняющие манжеты, кольца…

38 I. Serdyuk N. Zaccai J. Zaccai Physical methods in structural biology Cambridge, 2005 Introduction. From thermodynamic to single molecule detection Section A. Biological macromolecules and Physical Tools Section B. Mass and charge Section D. Hydrodynamics Section C. Thermodynamics Section E. Optical Spectroscopy Section F. Optical Microscopy Section G. X-ray and Neutron Diffraction Section H. Energy and Time Section J. Atomic resolution imaging Section K. Nuclear magnetic resonance Conclusion. Back to beginning…

39 Курс лекций проф. И.Н. Сердюк Физические методы в структурной биологии Введение. От термодинамики к одиночным молекулам Лекция 1. Макромолекулы как гидродинамические частицы Лекция 2. Диффузия, ультрацентрифугирование, электрофорез Лекция 3. Ориентация макромолекул в электрическом и гидродинамическом поле, вязкость, Лекция 4. Динамическое рассеяние света, флюоресцентная корреляционная спектроскопия, световая микроскопия Лекция 5. Флюоресцентная микроскопия, атомная силовая микроскопия, исследования на одиночных молекулах Лекция 6. Масс спектрометрия и термодинамика Лекция 7. Абсорбционная и инфракрасная спектроскопия, Рамановское рассеяние, оптическая активность Лекция 8. Ядерный магнитный резонанс Лекция 9. Макромолекулы как рассеивающие частицы. Рентгеноструктурный и нейтроноструктурный анализ Лекция 10. Малоугловое рассеяние, электронная микроскопия, двумерная инфракрасная спектроскопия Московский и Пущинский Государственные Университеты Центр подготовки специалистов при ИБ РАН.

40 Оптическое детектирование одиночных молекул в твердой фазе Исследуемые молекулы (pentacene) внедрены в поверхность кристалла (p-terpenyl crystal at 1.8 K). Концентрация молекул составляет ( M) (Moerner and Orrit, 1989). Изображения флюоресцентно меченых липидов на поверхности мембраны: А. Три разные концентрации липидов Б. Девять последовательных изображений поверхности снятые через определенные промежутки времени (35 микросек) при самой низкой концентрации липидов. Вычисленный коэффициент диффузии D lat = cm 2/ sec (Schmidt, et al, 1996) А Б