Выбор локусов для популяционно- генетического исследования Марина Владимировна Шитова, к.б.н. Институт Общей Генетики им. Н.И.Вавилова РАН

Речь пойдет только о микросателлитных локусах! Основное использование: Выявление и описание популяционно-генетической структуры вида на изучаемой части ареала. Накопление базы данных частот аллелей изучаемых локусов (бесконечно открытая или конечная) Идентификация (как групповая так и индивидуальная) для различных (прикладных и фундаментальных) целей Определение численности - общей и эффективной; пути миграций; границы личных территорий; родство особей в изучаемой группировке; места нагула… Таможенные изъятия; нелегальный промысел; прозрачность цепочки поставщик-покупатель; MSC

Из работы А.А.Тетериной, 2012 Оценка численности трески эхолотом и по повторным поимкам дали примерно одинаковые результаты. Что будет по генетическим маркерам?

1.Для сравнения Ваших результатов с уже имеющимся данным. 2. Для решения своих целей или целей Вашей лаборатории – База с нуля Определить цель: Для чего нужна панель локусов? От этого зависит свобода в выборе панели микросателлитных локусов !

Панель: 1. Дифференцирующая способность панели: крупномасштабная или мелкомасштабная 2. Размер – сколько локусов достаточно? Характеристики панели и используемых локусов Локусы: Интервал размеров аллелей Характеристики полиморфизма (гетерозиготность и взвешенное число аллелей) Структура микросателлита (ди-, три-, тетраповторяющаяся последовательность и др.)

Статьи и базы данных (Primer notes в Molecular Ecology Notes – National Center for Biotechnology Information (NCBI) – Шаг1: Где и Как выбирать микросателлитые локусы:

Программа по скринингу известных сиквенсов, например WebSat (Wellington et al., 2009, Bioinformation 3(6)) Поиск через клонирование (трудоемкий и дорогостоящий метод)

Дерево (NJ) построенное по фланкирующим районам Из работы Е.Г.Шайхаева, 2012 Дерево построенное на основе сравнения полокусных значений гетерозиготностей

Соответствует ли размер ПЦР-продукта разрешающей способности используемого метода Pper_6 (микросателлитный локус сахалинского тайменя) 1 gatgtaattt accttgtgtt gactacaccc ccacgtgcgc gcacacacac acacacacac 61 acacacacac acacacacac agtcntctga ttgtggtggc aatgaaactt tactgttctn 121 tanttcanga tgaaactatc ctcattgtta ttagtgttca 160 п.н. с оригинальными праймерам (gat) 113 п.н. с новыми праймерами ( tga ) В таком случае необходима шкала соответствий аллелей выраженная в кол-ве повторов !

Шаг 2: Получение ПЦР-продукта: Программа амплификации, температура отжига, время синтеза, кол-во циклов амплификации… Результат: Отсутствие продукта Слабый продукт Дуплицированный локус Много «шума» Ogo2 Oki1

Шаг3: Проверка локуса на полиморфизм в имеющихся популяциях Локус необходимо проверять на полиморфность, используя сборную выборку не менее 50 образцов со всех имеющихся у Вас частей ареала

Карта районов взятия выборок Западный Сахалин, Японское море 2-Южные Курилы 3-Северные Курилы 4-Западная Камчатка, Охотское море 5-Корякский район, Берингова моря 6-Наваринский район, Берингова моря 7-Канадские воды Gmo3 Из работы М.Е.Буряковой, % 9%

Количество аллелей в локусе, шт. Степень дифференциации, θ Исследовано: - 10 видов (нерка, кета, горбуша, сахал.таймень, тихоок.треска, атлант.треска, кунджа, микижа, соболь, тихоок.морж) локуса (общее кол-во) Средний размер выборки – от 20 до 60 особей

Шаг4: Если по исследованному локусу мы не обнаружили дифференциации между выборками, стоит ли отказываться от этого локуса? 1.Оценка общей дифференциации меняется, нельзя сравнивать с другими видами 2. Сложно предсказать картину изменчивости данного локуса в других, не исследованных популяциях

(van-Oosterhout et al., 2004, Mol.Ecol.Not., 4) Нуль-аллели (Null alleles) Статтеры (Stuttering) Крупные аллели (Large allele dropout) Шаг5: Проверка локусов на генетическое равновесие

12% 6,7% 7,6% 4,4% 5,7% 7,5% 0% 4,5% Исследовано 66 выборок из различных регионов Дальнего Востока Места сбора выборок и частота нуль-аллеля по локусу Oke3 Из работы С.Ю.Кордичевой, 2010

Подбор альтернативных праймеров к микросателлитному локусу Oke3 Oke3 1 ggatctgggc atgttatcac tttcagacac cacagcagta tgccctacct gagattcaaa 61ctctctgaac actactctat ctcctacacc actttaggca tcgagctaaa caccctgaga 121gcaatcaact cttgttcttt ctcactctta cactttgaag tccctctcgt ctctccctct 181cgtctctccc tctcgtctct ccctctcgtc tctccctctc gtctctccct ctcgtctctc 241cctctcgtct ctccctctcg tctctccctc tccttcgctc tttctctctc tctcaacccc 301ctgaaacaca ggggttgtgg tgatatctat tttcacaaat gtctaaacac tactatttac 361tgcatatccc tgatccttgt tttctctctc ttatctc сtс - микросателлитная последовательность сgс – оригинальные праймеры (Buchholz,W.G. et.al.,2000) сgс – альтернативные праймеры

Статтеры (Stuttering) Крупные аллели (Large allele dropout)

Проверка на селективную нейтральность (на отсутствие отбора по локусу) Рекомендации из статьи – Selkoe, Toonen, 2006, Ecology Letters (9). ENUMERATE или PYPOP – Ewens sampling distribution - тест FDIST2 или DETCEL – outlier loci - тест

Спасибо за внимание! не важно сколько у тебя ресурсов - главное как ты их используешь...