Стехиометрия процессов культивирования микроорганизмов Цель: научится составлять уравнение материального баланса процессов биосинтеза План Основные принципы стехиометрии Вывод «формулы» биомассы микроорганизмов Расчет выхода биомассы на углеродный субстрат Определение стехиометрических соотношений в реальных процессах ферментации (на примере биосинтеза лимонной кислоты) 1

Основные принципы стехиометрии В химических процессах: В химических процессах: n A A + n B B = n C C + n D D Подбор стехиометрических коэффициентов в уравнении (n A, n B, n C, n D ) осуществляем на основании закона сохранения материи 2 1.

Основные принципы стехиометрии В биохимических процессах: В биохимических процессах: Общее количество элементов, включенное в структуры клетки, равно количеству, взятому клеткой из питательной среды 3 1.

Основные принципы стехиометрии В биохимических процессах: В биохимических процессах: Продукты Субстраты Продукты n n С [углеродный субстрат] n X [биомасса] n N [азотный субстрат] n P [продукт n P [фосфорный субстрат] метаболизма] n O 2 [О 2 ] n CO 2 [CO 2 ].... n H 2 O [H 2 O] [биомасса] nX [биомасса] = (nX+1)

Основные принципы стехиометрии В биохимических процессах: В биохимических процессах: Продукты Субстраты Продукты n n С [углеродный субстрат] n X [биомасса] n N [азотный субстрат] n P [продукт n P [фосфорный субстрат] метаболизма] n O 2 [О 2 ] n CO 2 [CO 2 ].... n H 2 O [H 2 O] =

Вывод «формулы» биомассы Каков элементный состав биомассы? Каков элементный состав биомассы? Лесина Ю.А.6 2. Тип микроорганизмовЭлементный состав, % СНОNPSЗола Дрожжи47,06,530,07,51,51,06,5 Бактерии53,07,020,012,03,01,04,0 «Усредненный» 50,08,020,014,03,01,04,0 Таблица 1 – Элементный состав биомассы микроорганизмов (по данным элементного анализа)

Вывод «формулы» биомассы «Формула» дрожжи С 3,92 Н 6,5 O 1,88 N 0,54 P 0,05 S 0,03 бактерии С 4,42 Н 7,0 O 1,25 N 0,86 P 0,1 S 0,03 «усредненная» биомасса С 4,17 Н 8,0 O 1,25 N 1,0 P 0,1 S 0, Тип микроорганизмовЭлементный состав, % С/12Н/1О/16N/14P/31S/32 Дрожжи 3,926,51,880,540,050,03 Бактерии 4,427,01,250,860,10,03 «Усредненный» 4,178,01,251,00,10,03 Таблица 2 – Расчет числа грамм-атомов элементов в 100 г сухой биомассы

Вывод «формулы» биомассы «Формула» С-моль дрожжи С 3,92 Н 6,5 O 1,88 N 0,54 P 0,05 S 0,03 СН 1,66 O 0,48 N 0,14 бактерии С 4,42 Н 7,0 O 1,25 N 0,86 P 0,1 S 0,03 СН 1,58 O 0,28 N 0,19 «усредненная» С 4,17 Н 8,0 O 1,25 N 1,0 P 0,1 S 0,03 СН 1,92 O 0,3 N 0,24 биомасса СН 1,8 O 0,5 N 0,2 Молекулярная масса С-моля: Мr = ,81 + 0, ,214 = 24,6 С этого момента забудем о существующих мелких различиях в составах биомассы микроорганизмов! 8 2. С-моль - условный моль, приведенный к одному атому углерода Формула Стоутхаммера С-моля биомассы

Расчет выхода биомассы на углеродный субстрат Таблица 2 – Расчет стехиометрического выхода биомассы для различных субстратов СубстратХимическая формула Молекулярная масса субстрата Молекулярная масса С-моля субстрата Стехиометри- ческий выход биомассы Фактически измеренный выход биомассы, г/г Глюкоза С 6 Н 12 О ,820,5 Крахмал (С 6 Н 12 О 6 ) n 180n300,820,5 Целлюлоза (С 6 Н 12 О 6 ) n 180n300,820,5 Этанол C 2 H 5 OH46231,070,75 Метанол CH 3 OH ,5 Парафины (н-алканы) (CH 2 ) n H 2 14n + 2~14~1,761,0 Метан CH ,540,62

Определение стехиометрических соотношений в реальных процессах ферментации Проблемы расчета реальных процессов ферментации: затраты субстратов на поддержание жизнедеятельности микроорганизмов (непроизводительные затраты) фактический выход сильно зависит от условий и скорости роста биомассы одновременно протекающие процессы катаболизма и анаболизма Стехиометрические коэффициенты определяются из экспериментальных данных по потреблению субстрата и образованию продуктов биохимического взаимодействия

Определение стехиометрических соотношений в реальных процессах ферментации Общее стехиометрическое соотношение для объединенного процесса, включающего катаболизм и анаболизм ПРИМЕР: Экспериментально установлено, что в процессе ферментации на 1 кг потребленной сахарозы получается 0,6 кг лимонной кислоты и 0,3 кг сухой биомассы. Составить стехиометрическое уравнение для процесса биосинтеза лимонной кислоты. М (С 12 Н 22 О 11 ) = 342 г/моль М (С 6 Н 8 О 7 ) = 192 г/моль М (СН 1,8 О 0,5 N 0,2 )= 24,6 г/моль n S S + n O 2 [О 2 ] + n N [NH 3 ] X + n P [Р] + n CO 2 [CO 2 ] + n H 2 O [H 2 O] С-моль моль

Ответ: 12 n S [C 12 H 22 O 11 ] + n O 2 [О 2 ] + n N [NH 3 ] [CH 1,8 O 0,5 N 0,2 ] + + n P [C 6 H 8 O 7 ] + n CO 2 [CO 2 ] + n H 2 O [H 2 O] 0,24 0,26 0,2 1,0 0,66 0,32

Материальный баланс стадии ферментации m ст.ПС + m пос.мат. + m О 2 потр. ± m вл.возд. + (m долив. ) + m ст.пеног. = m к.ж. + m со 2 + m брызг. + (m отлив. ) m ст.ПС - масса стерильной питательной среды, кг m пос.мат. – масса посевного материала, кг m О 2 потр. – масса кислорода, потребленного из воздуха в процессе ферментации, кг m вл.возд. – масса влаги, принесенной (унесенной) из ферментатора, кг m долив./ m отлив. – масса доливов (отливов), если предусмотрены технологией, кг m ст.пеног. – масса стерильного пеногасителя, кг m к.ж. – масса культуральной жидкости, кг m со 2 – масса СО2, выделившегося в процессе ферментации, кг m брызг. – масса жидкости, унесенной из ферментатора в виде брызг, кг 13

Тепловой баланс ферментатора (на режиме ГД) Q 1 + Q 2 + Q 3 + Q 4 = Q 5 + Q 6 + Q 7 + Q 8+ Q 9 Q 1 - тепло, поступающее с исходными компонентами (питательная среда, посевной материал, воздух на стерилизацию), кДж Q 2 - тепло, поступающее с теплоносителем, кДж Q 3 - тепловой эффект биосинтеза, кДж Q 4 - тепловой эффект перемешивания, кДж Q 5 - тепло, уходящее с культуральной жидкостью, кДж Q 6 - тепло, уходящее с отработанным воздухом, кДж Q 7 - тепло, на нагрев (охлаждение) аппарата, кДж Q 8 - тепло, затраченное на испарение влаги из воздуха, кДж Q 9 - потери тепла в окружающую среду, кДж 14

Тепловой эффект биосинтеза (жизнедеятельности микроорганизмов) Q 3 = Q ж = Q M 0 + Q S – Q M – Q P Q M 0 – тепло, вносимое посевным материалом, кДж Q S – тепло, вносимое с компонентами питательной среды, кДж Q M – тепло, уходящее с мицелием, кДж Q P – тепло уходящее с продуктами биосинтеза, кДж Q = m i q сг.i 15 находим либо считаем

Тепловой эффект перемешивания Q 4 = N τ пер N – мощность, затрачиваемая на перемешивание (мощность электродвигателя), Вт τ – время перемешивания, ч 16

Задача 1 Определить влияние объема питательной среды и температуры стерилизации на время выдержки. Определить влияние объема питательной среды и температуры стерилизации на время выдержки. Объемы стерилизуемой среды 5,32, 50 м3. Температуры стерилизации 100, 120, 130 0С. Вероятность выживания N=0,01. Лесина Ю.А.17

Решение (см.ЛК 9,10) 18 К – удельная скорость гибели микроорганизмов, 1/мин N 0 – число микроорганизмов в стерилизуемом объекте N – конечное число микроорганизмов в стерилизуемом объекте. V, м3 Т, 0С К, мин-1 N, м.о. N 0, м.о. ln N 0 /Nτ выд., мин τ выд., ч 51000,0130, , ,543, ,4822,90, ,82,290, , , ,345, ,4824,120, ,82,410, , , ,646, ,4824,420, ,82,440,041

К - в расчетах используется К Bacillius stearothermothillus шт.1518 в зависимости от температуры (табл. 10.2) 19 Т, Сº К, мин Т, Сº К, мин Т, Сº К, мин N 0 = 10 6 м.о./мл х мл = N 0 = 10 6 м.о./мл х мл = N 0 = 10 6 м.о./мл х мл =

Задача 2 Рассчитать геометрический объем емкостного выдерживателя для стерилизации питательной среды. Исходные данные для расчета. Вероятность выживания микроорганизмов при непрерывной стерилизации принять 0,001. Обсемененность минеральных солей принять по обсемененности мела, подсолнечного масла – по зеленой патоке Состав концентрата питательной среды (вес.%) сахароза7,0 кукурузный экстракт3,0 сульфат калия0,15 соевая мука3,5 мел0,8 хлорид натрия0,4 подсолнечное масло0,6 2. Объем питательной среды, м Температура стерилизации, 0С. Температура стерилизации, 0С Плотность концентрата питательной среды, кг/м Объем конденсата, % от объема питательной среды15 6. Время операции стерилизации, ч3

Решение (см. ЛК 9,10) К = 7,4 мин -1, N = 0,001 К = 7,4 мин -1, N = 0,001 Лесина Ю.А.21 V ПС – объем стерилизуемой питательной среды с конденсатом, м3; τ стерил. – время стерилизации всей среды, ч; φ - коэффициент заполнения выдерживателя, 0,9 м3м3м3м3

Расчет No Рассчитаем массу концентрата ПС: Объем конденсата составляет V конд. = 35 15/100 = 5,25 (м 3 ) Объем концентрата ПС V конц.ПС = 35–5,25 = 29,75 (м 3 ) Масса концентрата ПС m конц.ПС = V ρ = 29, = 31832,5 (кг) Лесина Ю.А.22

Расчет No Рассчитаем обсемененность ПС Рассчитаем обсемененность ПС Лесина Ю.А.23 Компо- нент сахароза rукуруз- ный экстракт K 2 SO 4 соевая мука мелNaCl подсолн. масло вода водопров. Вес.%7,03,00,153,50,80,40,684,55 Масса, г 2228, , , , , , , , Обсеменен- ность, сп./г , Обсеменен- ность, сп. 1, , , , , , , , Обсеменен- ность концентр. ПС, сп. (1, ,76+0, ,04+0,0255+0,0127+0, ,77) 10 9 = 5840, (7,0+3,0+,0,15+3,5+0,8+0,4+0,6)=84,55 m конц.ПС вес.%\100 m комп.ПС(г) обсемененность, сп./г

Таблица 10.1 – Обсемененность компонентов питательных сред споровыми формами микроорганизмов Компонент средыЧисло спор в 1 г вещества Глюкоза( )·10 4 Сахароза( )·10 2 Зеленая патока4·10 2 Кукурузный экстракт( )·10 6 БВК0.7·10 4 Соевая мука( )·10 4 Кукурузная мука( )·10 6 Мел( )·10 2 Вода водопроводная(2-6)·10 2 Лесина Ю.А.24

Задача 3 Рассчитать оптимальный трубчатый выдерживатель для стерилизации питательной среды Рассчитать оптимальный трубчатый выдерживатель для стерилизации питательной среды Исходные данные для расчета: Исходные данные для расчета: Вероятность выживания микроорганизмов при непрерывной стерилизации принять 0, Объем среды, м Температура стерилизации, 0С Объем конденсата, % от объема стерильной ПС15 4. Плотность среды, кг/м Вязкость среды, Па с2, Время операции стерилизации, ч5

Решение Лесина Ю.А.26

27 м 3 /ч N 0 = 10 6 м.о./мл х мл =

Лесина Ю.А.28