Биокинетика Чернышев Андрей Витальевич (лекции) Некрасов Вячеслав Михайлович (семинары) р.т.:

Гл. 1. Введение в биокинетику Установление количественных закономерностей биологических процессов на молекулярном уровне Химическая кинетика - основа биокинетики Цель: Химические реакции Простые (элементарные)Сложные Мономолекулярные Бимолекулярные Тримолекулярные Параллельные Последовательные Циклические Смешанные Каскадные

простые (элементарные) сложные химические процессы - механизм реакции (совокупность элементарных стадий ) гомогенные гетерогенные замкнутые открытые системы

химическая кинетика - наука о скоростях и механизмах химических превращений стехиометрическим уравнение: стехиометрические коэффициенты исходные промежуточные конечные вещества

Скорость химической реакции V = const Элементарная реакция: w = число элементарных актов реакции в единице объема в единицу времени. Сложная реакция: может быть введено понятие единой скорости процесса, когда концентрации промежуточных веществ пренебрежимо малы по сравнению с концентрациями реагентов и продуктов реакции (иначе - скорость реакции по конкретному веществу).

Закон действующих масс константа скорости порядок реакции по n -му реагенту полный порядок реакции: (Аррениус, 1889) энергия активации предэкспонент Аррениусовские координаты:

Закон действующих масс с учетом микроскопических состояний

Влияние pH на скорость химической реакции

Q - тепловой эффект реакции E реагенты продукты экзоэргическая эндоэргическая эндотермическая экзотермическая колебательный уровень:

Метод графов при анализе кинетических схем Граф – совокупность точек (вершин) и соединяющих их линий (дуг, ветвей, ребер) часто скорость переноса можно представить в виде: скорость переноса: вес ветви

принцип независимости элементарных стадий: обратимые реакции равновесие: константа равновесия Теория активированного (переходного) комплекса позволяет рассчитать константу скорости:

Теория активированного (переходного) комплекса Статистические суммы:

Кинетический эксперимент Теорема Найквиста: источники ошибок:

Гл. 2. Ферментативный катализ Схема Михаэлиса-Ментен: фермент субстрат комплекс константа Михаэлисамаксимальная скорость стационарная скорость

СхемаWmWm KmKm Некоторые кинетические схемы, приводящие к уравнению Михаэлиса

Определение параметров W m и K m из экспериментальных данных 1) Метод двойных обратных координат 2) Метод Скэтчарда (Иди-Хофсти)

Определение концентрации активных центров: По содержанию белка (если один активный центр) Путем необратимого ингибирования Определение имитирующей стадии: Измерение нестационарной кинетики Использование субстратов с различной структурой и различной реакционной способностью 1. 2.

Типичные зависимости начальной стационарной скорости реакции от концентрации субстрата - аллостерическими эффектами - ингибированием или активацией реакции избытком субстрата Отклонения от Михаэлевской (а) зависимости могут быть вызваны:

Ингибирование и активация избытком субстрата > 1 – активация субстратом < 1 – ингибирование субстратом

Аллостерический эффект – изменение конформации и каталитической активности в результате связывания неосновного центра n центров: - определение числа связывающих центров

Многосубстратные реакции Механизм тройного комплекса Пинг-понг механизм

Нестационарная кинетика ферментативных реакций Предстационарная кинетика многостадийной реакции i – собственные значения матрицы B ij A ij и A 0 – константы

Релаксационная кинетика При быстром внешнем воздействии на систему (изменение температуры, давления, пр.) время, которое нужно системе для достижения нового равновесия (или стационарного состояния), зависит от скорости химической реакции (и иногда от скорости диффузии реагентов). резко меняется температура: T T 0 + T меняется константа равновесия: K K 0 + K Кинетика перехода в новое равновесное состояние: Если отклонение от равновесия невелико: - время релаксации

Ингибирование ферментативных реакций обратимые ингибиторы (пестициды, зарин, зоман, аспирин и др.) необратимые ингибиторы (окись углерода, цианид-ион, анальгин и др.) Инактивация ферментов активныйнеактивный - тепловая денатурация - изменение pH - денатурирующие агенты - окисление кислородом - ультразвук - радиация конформационные изменения (изменение спектров поглощения и флуоресценции) мс - обратимые мин - необратимые

1. Простейшая кинетическая схема инактивации с равновесием конформеров: 2. Инактивации подвержены оба конформера: 3. Более общий случай для системы с участием n конформеров:

4. Диссоциативный механизм инактивации: 5. Инактивация в процессе реакции:

Методы дискриминации механизмов инактивации и определения кинетических характеристик реакции: - анализ зависимости выхода продукта от концентрации фермента; - зависимость степени конверсии субстрата от степени инактивированности фермента; - проведение реакции при низких степенях конверсии субстрата и низких концентрациях фермента; - проведение реакции при больших концентрациях фермента; - предынкубация фермента с компонентами реакции; - использование интегральных уравнений реакции.

Полиферментные системы. Сопряженные ферментные реакции избыток S 1 : V 2m >>W 1 : S 2 /K 2m

Рассмотрим общий случай в условиях бимолекулярного режима (S i

Кинетика действия ферментов в открытых системах обмен компонента с окружающей средой : -все живые организмы; -технологических процессы в промышленности. Типы открытых систем: -по субстрату -по продуктам Типы реакторов: -идеального перемешивания -идеального вытеснения -мембранный D – коэффициент диффузии v – скорость ламинарного потока

Реактор идеального вытеснения в стационаре: Реактор идеального перемешивания

Гл. 3. Молекулярная рецепция Рецепторы – химические соединения на поверхности или внутри клеток, посредством которых происходит распознавание веществ (лигандов) и формирование клеточного ответа. Лиганды – химические вещества, способные реагировать с рецепторами. Если L >> R: - изотерма Ленгмюра (сорбции) - уравнение Скэтчарда

рецепторы - белки, различающиеся разными участками или третичной структурой; - трансмембранные белки; - образуют четвертичную структуру с углеводами, гликопротеидами, фосфолипидами мембран; - в процессе функционирования может меняться третичная и четвертичная структуры (конформация рецептора, структура и состав связанных с ним молекул) и сам рецептор (фосфорилирование и дефосфорилировать и др.); - центры связывания лигандов: COOH-группы дикарбоновых кислот, NH2-группы диаминовых кослот, OH-группы гидроксиаминокислот, SH-группы цистеина, гидрофобные участки аминокислот и др.; - участвует несколько активных участков связывающего центра; - большая степень сродства к лигандам, чем у ферментов к субстратам. лиганды - различное химическое строение (белковые, пептидные и др.)

Лиганды: Агонисты – связываясь с рецепторами, активно вызывают биологический ответ клетки (стимулируют клеточные функции). Антагонисты – не вызывают активного клеточного ответа, препятствуют связыванию агонистов с рецепторами (угнетают кл. функции). Принцип структурной комплиментарности (ключ-замок) Проведение и усиление рецепторного сигнала: - максимальный биологический ответ клетки наблюдался даже тогда, когда лишь незначительная часть рецепторов связана с лигандами; - кривая зависимости биологического ответа клетки от концентрации добавленного лиганда во многих случаях имеет сложный колоколообразный вид; - различие механизма действия агонистов и антагонистов рецепторов одного типа.

Вторичные мессенджеры – внутриклеточные молекулы, осуществляющие сопряжение рецепторов с внутриклеточными эфферентными системами (ферментами, ионными каналами, геномом и т.д.). Первичными мессенджерами раньше называли лиганды, так как многие из лигандов осуществляют сопряжение эндокринных желез с эфферентными клетками. Классификация рецепторов по их сопряжению со вторичными мессенджерами: - рецепторы-ионные каналы (несколько глобул интегральных белков на мембране, в неактивном состоянии рецептора ионный канал закрыт); - рецепторы, сопряженные с ферментами (одна из глобул белка-рецептора обладает каталитической активностью, образование лиганд-рецепторного комплекса приводит к изменению каталитической активности); - рецепторы сопряженные с G-белками (рецепторная молекула сопряжена в с внутриклеточной стороны с особым ГТФ-связывающим белком, - G-белком, - через G-белок рецепторы могут менять активность внутриклеточных ферментативных систем и вызывать открытие ионных каналов).

G-белок сопряженные рецепторы - семь раз пронизывает цитоплазматическую мембрану; - NH 2 -конец располагается внеклеточно; - три внутриклеточных и три внеклеточных петли; - лиганды обычно связывает вторая внеклеточная петля; - оканчивается внутри клетки гидрофильным COOH-концом; - третья внутриклеточная петля и COOH-конец осуществляют сопряжение с G-белком. - состоит из двух субъединиц: и ; - -субъединица связывает ГТФ; - - субъединица осуществляет крепление G-белка к цитолазматической мембране; - -субъединица связывается с COOH концом и третьей петлей рецептора; - - субъединица связывается только с COOH-концом. G-белок 1) G s -белки ( s-субъединица, стимулируют АТФцАМФ, ингибируют Ca 2 + каналы); 2) G i -белки (ингибируют АТФцАМФ); 3) G o -белки (угнетают потенциал-зависимые Ca 2 + каналы, стимулируют К + каналы); 4) др.

Схема функционирования G-сопряженного рецептора: G-белков молекул цАМФ усиление в раз! х цАМФ в раз!!

Механизмы внутриклеточного проведения и усиления рецепторного сигнала теоретический коэффициент усиления: ! однако: ограниченная концентрация субстратов концентрация вторичных мессенджеров ~ M концентрация LR комплексов: М реальный коэфф. усиления:

Инактивация рецепторного сигнала I. Уменьшение концентрации LR комплексов: а) Диссоциация LR (напр. из-за уменьшения концентрации лигандов в растворе вследствии разрушения лиганда ферментами). б) Повышение константы скорости диссоциации лиганд-рецепторного комплекса (активация рецептора). в) Изменение концентрации свободных или связанных рецепторов на мембране (эндоцитоз и экзоцитоз). II. Инактивация сопряжения LR комплеска с ферментами: а) Самоинактивация -субъединицы G-белка (ГТФ-азная активность - субъединицы). б) Десенситизация ферментной системы (процессы фосфорилирования- дефосфорилирования, метилирования-деметилирования рецептора, G-белков, ферментов и т.д.). III. Инактивация фермента, синтезирующего ключевые регуляторы клеточного ответа (напр. инактивация вторичным мессенджером – арахидоновой кислотой – ферментов синтеза эйкозаноидов (простагландинов, тромбоксанов, липоксинов) IV. Взаимодействие лиганда с различными типами рецепторов: 1) стимулирует2) ингибирует3) не влияет

Дискриминация моделей 1) Ингибиторование рецепторов (использование конкурентных антагонистов). 2) Ингибирование мембранного транспорта (разрушение клеток). 3) Уменьшение мембранного транспорта пептидных фрагментов. 4) Уменьшение эндоцитоза (мембранные стабилизаторы). 5) Увеличение проницаемости мембран (пермиолизаторы). 6) Использование димеров лигандов (димеры труднее диффундируют). 7) Использование ингибиторов макроэргов (уменьшение скорости энергозависимых процессов транспорта и деградации ферментов). 8) Ингибирование ферментов (уменьшение скорости деградации лигандов). 9) Добавление ионов металлов (меняют аффинность рецепторов). 10) Изменение pH, ионной силы, температуры (транспорт, деградация, связывание и пр.).

Диффузия рецепторов трехмерная - внутриклеточные двухмерная -поверхностные Связываение нескольких молекул лиганда с одним рецептором сродство меняется – кооперативное связывание возрастает – положительная убывает - отрицательная сильно выраженная положительная кооперативность избыток лиганда:

Координаты Хилла Тангенс угла наклона ( ) связан со степенью коопретивности: > 1положительная кооперативность, < 1отрицательная коперативность, = 1отсутствие кооперативности. Координаты Бьеррума Число перегибов равно числу типов мест связывания. Абцисса точки перегиба равна логарифму константы диссоциации. степень насыщения

1) Конкуренция за места связывания: а) неконкурентное (разные места связывания); б) конкурентное (одно место связывания); в) бесконкурентное (лиганд L2 связывается с L1R комплексом). 2) Изменение аффинности рецепторов: а) без изменения аффинности (L1R и R имеют одинаковую аффинность к L2); б) с изменением аффинности. 3) Наличие взаимодействия между лигандами: а) без взаимодействия L1 и L2; б) с взаимодействием.

Феномен колебаний рецепторного связывания 1991 г. - периодические (период порядка 10 минут) - апериодические модулятор [RL] (t) Возможным источником колебаний может быть соотношение ГТФ / ГДФ, возникающее при гликолитических колебаниях.

Учет функции распределения клеток по количеству рецепторов на мембране

метод характеристик: (функция остается самоподобной)

Учет функции распределения по константам реакции число рецепторов с афинностью K на клетке

Гл. 4. Клеточный рост Клеточный цикл: 1 час (эмбриональные и микробные клетки) ~10 лет (гепатоциты, нейроны).

Культивирование клеток -> изучение клеточного цикла in vitro (культуры, линии клеток). Фазы роста: 1) индукционный (лаг-фаза) – адаптация клеток к среде, перестройка их метаболизма; 2) экспоненциальный рост (много митозов); 3) линейный рост (мало митозов); 4) замедление роста; 5) стационарная фаза; 6) отмирание культуры. Причины замедления роста – истощение субстрата, накопление токсических продуктов и др.

Экспоненциальная фаза роста Предположим, что скорость роста лимитируется одним субстратом S: удельная скорость роста: (уравнение Моно) Типичные значения: m ~ 10-2 ÷ 10-5 c-1, K S ~ 10-2 ÷ 10-8 M.

Многосубстратные процессы пример (M. thermoautotrophicum): возможные механизмы: тройной комплекс пинг-понг

Ингибирование и активация клеточного роста Классификация: По мишени: а) ингибиторы, действующие на ДНК (налидиксоновая кислота), б) ингибиторы, действующие на РНК (актиномицин), в) ингибиторы синтеза белка (хлорамфеникол, эритромицин, тетрациклин), г) ингибиторы синтеза клеточной стенки (пенициллин), д) мембраноактивные вещества (толуол, хлороформ), е) ингибиторы энергетических процессов (2,4 - динитрофенол), ж) ингибиторы лимитирующего фермента. По кинетике действия: а) необратимые, б) обратимые.

ингибирование субстратом

Влияние pH - на субстрат (аминокислоты); - на ферменты клетки. Кинетика переноса ионов водорода через мембрану клетки: В условиях равновесия:

Замедление скорости роста Лимитирование по субстрату (линейная связь) предел роста: - интегральное уравнение Моно

Ингибирование избытком субстрата

Ингибирование субстратом в условиях истощения по субстрату

Ингибирование продуктами

Период индукции 1) Трансформация предсубстрата в субстрат: период индукции:

2) Адаптация: период индукции:

3) Расход ингибитора роста: период индукции:

Старение клеток и апоптоз Апоптоз – программируемое старение и гибель клеток. Некроз – гибель случайная или под действием внешних токсинов г., Л. Хейфлик: предел клеточного деления для фибробластов человека (50 делений). - бактериальные клетки и клетки одноклеточных организмов делятся бесконечно; - клетки многоклеточных организмов имеют предел деления. Концепция программируемого старения: ДНК полимераза не способна реплицировать хвосты 3 конца матрицы ДНК (несколько нуклеотидов на 3 конце). Для предотвращения укорачивания ДНК фермент теломераза синтезирует на концах ядерной ДНК многократно повторяемый гексануклеотид TTAGGG (теломера). Таким образом, для преодоления укорачивания генома и старения клетка должна активировать теромеразный ген и экспрессировать большое количество теломеразы.

Удельная скорость клеточного роста в экспоненциальной фазе Предположения: - скорость синтеза ДНК пропорциональна концентрации S и характеризуется константой скорости R; - скорость биосинтеза лимитирующего фермента и белков репликационного комплекса намного выше скорости синтеза ДНК, так что можно считать E=const. В квазистационаре: время репликации базовое количество ДНК

Многостадийность клеточного цикла время репликации нахождения в других фазах клеточного цикла время удвоения: уравнение Моно Микробы: Многоклеточные:

Старение клетки в процессе роста Инактивация ключевых ферментативных систем: - репликационного комплекса, - лимитирующего фермента. В квазистационаре: пороговая концентрация S

Кинетические модели апоптоза 1) Прогрессирующая некомпетентность: способные к делению клетки Возможна ситуация:(максимальное количество некомпетентных клеток) Если a дается уравнением Моно, то: t m - время достижения максимума по N a

1) начальный период: 2) режим истощения субстрата (на больших временах):

2) Запрограммируемый отказ - потеря чувствительности клеток к ростовым факторам среды (т.е. уменьшением числа рецепторов R на клетке) Предположим, что скорость деления клеток пропорциональна числу рецепторов на мембране: Если >>

Модель хищник-жертва жертва хищник Существует стационарное состояние: Фазовый портрет (связь между N1 и N2): фазовый портрет колебательной траектории Средняя численность популяции равна стационарной численности

Ассоциации микроорганизмов симбиоза до антагонизма Пример: ассоциация двух микроорганизмов M1 и M2

Гл. 5. Мембранный транспорт Мембраны: - kлеточные - внутриклеточные Строение мембраны: - липиды и белки, билипидный слой (гидрофобная часть внутри) - мембранные поры: диаметр 8÷14 А длина (толщина мембраны) ~160 А - разность электрических потенциалов внутренней и внешней поверхности (сказывается на транспорте ионов). Виды мембранного транспорта: - пассивная диффузия (по градиенту химического или электрохимического потенциала); - облегченная диффузия (обратимое взаимодействие с переносчиком); - активный транспорт (против градиента); - транслокация групп (изменение вещества при транспорте, переносчик-фермент).

Пассивный транспорт число Фарадея заряд (целое число, в единицах электронов) i-го иона потенциал электрического поля в мембране Одномерный случай: в линейном приближении: Коэффициент проницаемости: подвижность Если молекула не заряжена: В равновесии (J = 0): (уравнение Нерста) Доннаново равновесие

Активный ионный транспорт модель K + -Na + насоса Na-конформер К-конформер

Реакционная схема (учитывая кооперативный эффект и наличие пассивной диффузии)

модель Ca 2+ насоса Напишите реакционную схему (учитывая кооперативный эффект и наличие пассивной диффузии)

Высокая селективность ионных каналов к определенному типу ионов натриевый канал: калиевый канал:

Гл. 6. Эндоцитоз Ранняя эндосома Пузырек с гидролазами Поздняя эндосома лизосома Возврат рецептора в плазмалемму Возврат рецептора м-6-ф в АГ

- распознавание целевой мембраны транспортным пузырьком

ПиноцитозФагоцитоз первичная лизосома вторичная лизосома остаточное тельце: - внутри клетки - снаружи клетки аппарат Гольджи

Сообщество микробных популяций в реакторе идеального перемешивания Популяции микробов Контролирующие рост факторы Существует стационарное состояние:

Распределение микробов по скорости роста и возрасту s 01 с точностью до обозначений эквивалентно: рост возраст

Матричный анализ стационарного состояния - размера [n × m] - размера [m × n] размера [m × m] Квантование ! следствие популяций факторов

Гемолиз в изотоническом хлориде аммония H 2 O+NH 4 Cl Осмотические и буферные свойства эритроцита Мембранный транспорт Динамика разрушения мембраны при ее растяжении Составные части общей модели: + +

Механизм проникновения NH 4 Cl в эритроцит NH 3 H+H+ NH + 4 Cl - NH 3 NH + 4 H+H+ OH - H2OH2O Band 3 NH 4 Cl Hb Hb - Band 3 HCO - 3 Cl - CO 2 H 2 CO 3 Изменение pH in + Цикл Якобса-Стюарта (Jacobs-Stewart cycle)

Пинг-понг механизм работы band 3 Лимитирующая стадия – транслокация band 3

Три стадии гемолиза 1.Быстрое увеличение (на ~20%) начального объема (< 0.2 сек) - релаксация клетки в новой среде: 2. Медленное дальнейшее увеличение объема до сферы (> 10 сек): 3. Растяжение сферической клетки со спонтанным разрывом (> 10 сек): напряженность мембраны время жизни мембраныконцентрация клеток

Функция распределения эритроцитов Параметры: Функция распределения: где логнормальная функция: Время сферизацииВремя жизни сферы Монте-Карло алгоритм моделирования динамики функций распределения сферизованных эритроцитов

Динамика метаболизма в эритроците человека История моделирования Palsson et al. (1989)

Аббревиатура метаболитов эритроцита

Краткое описание метаболизма эритроцита

Основные ограничения: 1) Электронейтральность 2) Баланс осмотического давления (буферные свойства)

Трансмебранный K + /Na + обмен

Трансмебранный Cl - /HCO 3 - обмен

Кинетика гликолиза

Сравнение модели с экспериментом

Предсказания модели