Получение гаплоидов и манипуляции с плоидностью для повышения эффективности селекции растений Получение гаплоидов и манипуляции с плоидностью для повышения эффективности селекции растений

Гаплоидами у покрытосеменных растений называют особи, имеющие гаметический набор хромосом по отношению к уровню плоидности родительской особи. Удвоение хромосом у гаплоидов диплоидных видов (получение удвоенных гаплоидов) позволяет получать гомозиготные линии, которые представляют значительный интерес для селекции. Гаплоидами у покрытосеменных растений называют особи, имеющие гаметический набор хромосом по отношению к уровню плоидности родительской особи. Удвоение хромосом у гаплоидов диплоидных видов (получение удвоенных гаплоидов) позволяет получать гомозиготные линии, которые представляют значительный интерес для селекции. Гаплоиды могут возникать естественным путем в результате нарушения процесса оплодотворения из неоплодотворенных яйцеклеток или других клеток зародышевого мешка, при элиминации хромосом одного из родителей в зиготе или замещении ядра яйцеклетки ядром спермия. Первым растением, которое было идентифицировано в качестве гаплоида, был дурман Datura stramonium (Solanacea), выявленное A.F. Blakeslee в 1921 году. Позже гаплоиды были обнаружены и у многих других растений, однако частота их появления в природе оказалось крайне незначительной (0,001 – 0,01%) и не могла удовлетворить потребности генетики и селекции. Гаплоиды могут возникать естественным путем в результате нарушения процесса оплодотворения из неоплодотворенных яйцеклеток или других клеток зародышевого мешка, при элиминации хромосом одного из родителей в зиготе или замещении ядра яйцеклетки ядром спермия. Первым растением, которое было идентифицировано в качестве гаплоида, был дурман Datura stramonium (Solanacea), выявленное A.F. Blakeslee в 1921 году. Позже гаплоиды были обнаружены и у многих других растений, однако частота их появления в природе оказалось крайне незначительной (0,001 – 0,01%) и не могла удовлетворить потребности генетики и селекции.

Для редукции числа хромосом у растений применяют два основных подхода: – андрогенез (от греч. andros – мужчина и… генез) в культуре in vitro пыльников или микроспор, – андрогенез (от греч. andros – мужчина и… генез) в культуре in vitro пыльников или микроспор, – гиногенез (от греч. gyne – женщина и… генез) из неоплодотворенных яйцеклеток или других гаплоидных клеток зародышевого мешка в культуре in vitro, а также из имеющих гаплоидный зародыш семян, полученных при опылении материнского растения пыльцой другого вида или специального гаплоиндуктора. – гиногенез (от греч. gyne – женщина и… генез) из неоплодотворенных яйцеклеток или других гаплоидных клеток зародышевого мешка в культуре in vitro, а также из имеющих гаплоидный зародыш семян, полученных при опылении материнского растения пыльцой другого вида или специального гаплоиндуктора.

Культура in vitro пыльников и микроспор Высшие растения имеют жизненный цикл, в котором чередуются фазы гаплоидного гаметофита и диплоидного спорофита. Во время фазы гаметофита материнские клетки пыльцы, находящиеся в пыльнике, претерпевают мейотическое и митотическое деления, результатом которых является образование мужского гаметофита – пыльцевых зерен. Высшие растения имеют жизненный цикл, в котором чередуются фазы гаплоидного гаметофита и диплоидного спорофита. Во время фазы гаметофита материнские клетки пыльцы, находящиеся в пыльнике, претерпевают мейотическое и митотическое деления, результатом которых является образование мужского гаметофита – пыльцевых зерен. Под воздействием определенных воздействий в условиях культуры пыльников in vitro некоторые микроспоры способны менять программу развития с гаметофитной на спорофитную и давать, в результате, начало эмбриоидам или образовывать каллюс. Из эмбриоидов или каллюса можно получить растения- регенеранты, которые являются гаплоидами или удвоенными гаплоидами. Это явление получило название андрогенеза или пыльцевого эмбриогенеза (pollen embryogenesis, microspore embryogenesis) Под воздействием определенных воздействий в условиях культуры пыльников in vitro некоторые микроспоры способны менять программу развития с гаметофитной на спорофитную и давать, в результате, начало эмбриоидам или образовывать каллюс. Из эмбриоидов или каллюса можно получить растения- регенеранты, которые являются гаплоидами или удвоенными гаплоидами. Это явление получило название андрогенеза или пыльцевого эмбриогенеза (pollen embryogenesis, microspore embryogenesis)

Культура in vitro пыльников и микроспор Возможность получения гаплоидов путем культивирования in vitro пыльников растений впервые была продемонстрирована в 1964 г сотрудниками Отдела ботаники Университета г. Дели (Индия) S. Guha и S.C. Maheswari Возможность получения гаплоидов путем культивирования in vitro пыльников растений впервые была продемонстрирована в 1964 г сотрудниками Отдела ботаники Университета г. Дели (Индия) S. Guha и S.C. Maheswari В 1973 году французские ученые С. Nitsch и В. Norreel впервые получили гаплоидные эмбриоиды путем культивирования in vitro микроспор Datura innoxia, изолированных из пыльников. В 1973 году французские ученые С. Nitsch и В. Norreel впервые получили гаплоидные эмбриоиды путем культивирования in vitro микроспор Datura innoxia, изолированных из пыльников.

Культура пыльников

Культура in vitro пыльников и микроспор Культура микроспор пшеницы (по Zheng, 2003): Колоски, погруженные в питательную среду, измельчают с помощью блендера. Колоски, погруженные в питательную среду, измельчают с помощью блендера. Полученный гомогенат фильтруют последовательно через сетчатые фильтры с размером ячеек 100 μм и 38 μм, чтобы отделить микроспоры от грубых остатков тканей и клеток. Полученный гомогенат фильтруют последовательно через сетчатые фильтры с размером ячеек 100 μм и 38 μм, чтобы отделить микроспоры от грубых остатков тканей и клеток. Микроспоры, собранные на фильтре с размерами ячеек 38 μм, смывают раствором 0,3 М маннитола, наслаивают на 0,58 М раствор мальтозы и центрифугируют при небольшой скорости ( g). Жизнеспособные эмбриогенные микроспоры располагаются на границе этих двух растворов, в то время как другие клетки и примеси оказываются в осадке. Фракцию микроспор несложно собрать с помощью автоматической пипетки и перенести в жидкую питательную среду для культивирования. Микроспоры, собранные на фильтре с размерами ячеек 38 μм, смывают раствором 0,3 М маннитола, наслаивают на 0,58 М раствор мальтозы и центрифугируют при небольшой скорости ( g). Жизнеспособные эмбриогенные микроспоры располагаются на границе этих двух растворов, в то время как другие клетки и примеси оказываются в осадке. Фракцию микроспор несложно собрать с помощью автоматической пипетки и перенести в жидкую питательную среду для культивирования.

Культура микроспор

Формирование пыльцевых зерен (гаметофитный путь развития) у высших растений

Изменение программы развития с гаметофитной на спорофитную Изменение программы развития с гаметофитной на спорофитную в культуре in vitro происходит только в том случае, когда - микроспоры находятся на определенной стадии развития - микроспоры находятся на определенной стадии развития - являются чувствительными (компетентными) к различным внешним воздействиям, способным вызвать такое изменение программы. - являются чувствительными (компетентными) к различным внешним воздействиям, способным вызвать такое изменение программы. Имеется достаточно много экспериментальных данных, указывающих на связь между андрогенетической способностью генотипа и формированием микроспор определенного типа (эмбриогенных). Было показано, что число эмбриогенных микроспор детерминировано для конкретных растений-доноров пыльников и не увеличивается в ходе культивирования пыльников, а условия культивирования лишь способствуют или препятствуют реализации их развития. Теория, которая считает приоритетной роль эмбриогенных микроспор в процессах андрогенеза в культуре пыльников и микроспор, получила название теории детерминации [Heberle- Bors 1985]

Эмбриогенные микроспоры Эмбриогенные микроспоры имеют существенные ультраструктурные и функциональные отличия от нормальных микроспор. Для них характерно смещение вакуоли от центра к экзине на вакуолярной стадии развития микроспор и последующая реадсорбция вакуоли на двухядерной стадии с сохранением ее видимых фрагментов возле экзины; в результате формируется специфическая, так называемая «звездчатая структура», состоящая из цитоплазматических тяжей, соединяющих перинуклеарную и субкортикальную области цитоплазмы. Отмечается менее плотная цитоплазма, отсутствие накопления крахмальных зерен, характерное для нормальных созревающих генеративных клеток, происходит изменение клеточного цикла. Было обнаружено образование в эмбриогенных микроспорах в ходе культивирования in vitro специфической мРНК, не присутствующей в нормальных микроспорах, что говорит о транскрипции у них особых генов, связанных с развитием по спорофитному пути.

Эмбриогенные микроспоры

Пыльцевой диморфизм

Пути формирования эмбриоидов или каллюса из эмбриогенных микроспор А-путь. Микроспора подвергается первому неравному митотическому делению. В дальнейшем происходят симметричные деления только вегетативной клетки, в результате чего образуются гаплоидные эмбриоиды. Генеративная клетка не делится и погибает. А-путь. Микроспора подвергается первому неравному митотическому делению. В дальнейшем происходят симметричные деления только вегетативной клетки, в результате чего образуются гаплоидные эмбриоиды. Генеративная клетка не делится и погибает. Е-путь. Микроспора подвергается первому неравному митотическому делению, в дальнейшем происходят симметричные деления генеративной клетки. В результате образуются гаплоидные эмбриоиды или каллюс. Е-путь. Микроспора подвергается первому неравному митотическому делению, в дальнейшем происходят симметричные деления генеративной клетки. В результате образуются гаплоидные эмбриоиды или каллюс. В-путь. Первое митотическое деление, в отличие от нормального, является симметричным, что приводит к формированию двух одинаковых вегетативных клеток. Их последующее митотическое деление ведет к образованию многоклеточных структур. Развитие по В-пути обычно приводит к формированию гаплоидных или диплоидных эмбриоидов (удвоенных гаплоидов) В-путь. Первое митотическое деление, в отличие от нормального, является симметричным, что приводит к формированию двух одинаковых вегетативных клеток. Их последующее митотическое деление ведет к образованию многоклеточных структур. Развитие по В-пути обычно приводит к формированию гаплоидных или диплоидных эмбриоидов (удвоенных гаплоидов) С-путь. Микроспора претерпевает нормальное митотическое деление, в результате которого формируются вегетативное и генеративное ядра. Затем ядра сливаются, последующие митотические деления приводят к образованию многоклеточных структур, которые в дальнейшем развиваются посредством эмбриоидогенеза или каллюсогенеза, давая начало преимущественно удвоенным гаплоидам. С-путь. Микроспора претерпевает нормальное митотическое деление, в результате которого формируются вегетативное и генеративное ядра. Затем ядра сливаются, последующие митотические деления приводят к образованию многоклеточных структур, которые в дальнейшем развиваются посредством эмбриоидогенеза или каллюсогенеза, давая начало преимущественно удвоенным гаплоидам.

Факторы, оказывающие влияние на эффективность андрогенеза в культуре пыльников и микроспор: - Генотип - Физиологическое состояние и условия культивирования растений-доноров пыльников или микроспор - Оптимальная фаза развития микроспор - Экспериментальные воздействия на растения- доноры пыльников или эксплантаты до начала культивирования (обработка ФАВ, стрессовые воздействия) - Экспериментальные воздействия на растения- доноры пыльников или эксплантаты до начала культивирования (обработка ФАВ, стрессовые воздействия) - Состав и консистенция питательной среды, условия культивирования эксплантатов

Определение плоидности растений-регенерантов

Проблема альбинизма растений-регенерантов

Получение гаплоидов с помощью культуры неоплодотворенных семяпочек и завязей

В качестве эксплантатов для культивирования in vitro обычно используют молодые неоплодотворенные семяпочки или завязи. Так, для сахарной свеклы оптимальный вариант предполагает использование в качестве эксплантатов семяпочек из закрытых бутонов со средней части соцветия, которые содержат недифференцированные 8-ядерные зародышевые мешки. После помещения на питательную среду развитие женского гаметофита, в отличие от мужского, продолжается и в результате образуется зрелый зародышевый мешок. По спорофитному пути, как правило, развивается, при определенных условиях культивирования, яйцеклетка. В качестве эксплантатов для культивирования in vitro обычно используют молодые неоплодотворенные семяпочки или завязи. Так, для сахарной свеклы оптимальный вариант предполагает использование в качестве эксплантатов семяпочек из закрытых бутонов со средней части соцветия, которые содержат недифференцированные 8-ядерные зародышевые мешки. После помещения на питательную среду развитие женского гаметофита, в отличие от мужского, продолжается и в результате образуется зрелый зародышевый мешок. По спорофитному пути, как правило, развивается, при определенных условиях культивирования, яйцеклетка.

Получение гаплоидов с помощью гаплопродюсеров Развитие гаплоидов из женских половых клеток можно индуцировать in situ (лат.: на месте) путем: опыления пыльцой другого вида, опыления пыльцой другого вида, того же вида, того же вида, облученной пыльцой. облученной пыльцой. Возможны два основных механизма возникновения гаплоидов в результате таких опылений: - после оплодотворения яйцеклетки образуется гибридный зародыш, в котором на ранних стадиях эмбриогенеза происходит элиминация хромосом одного из родителей (чаще всего опылителя); - оплодотворение яйцеклетки не происходит, но стимулируется к дифференцировке - оплодотворение яйцеклетки не происходит, но стимулируется к дифференцировке

Гаплопродюсеры: Материнские растения культурного ячменя Hordeum vulgare (2n=2x=14) опыляют пыльцой дикого ячменя H. bulbosum (2n=2x=14). Используют эмбриокультуру Материнские растения культурного ячменя Hordeum vulgare (2n=2x=14) опыляют пыльцой дикого ячменя H. bulbosum (2n=2x=14). Используют эмбриокультуру Для получения гаплоидов пшеницы ее опыляют пыльцой кукурузы, сорго, теосинте, декоративного проса Pennisetum glaucum, дикого ячменя H. bulbosum Для получения гаплоидов пшеницы ее опыляют пыльцой кукурузы, сорго, теосинте, декоративного проса Pennisetum glaucum, дикого ячменя H. bulbosum Дигаплоиды (2n = 2x = 24) культурного картофеля S. tuberosum L. получают путем опыления растений картофеля (2n = 4x = 48) пыльцой S. phureja (2n = 2x = 24) (гаплопродюсеры с маркерным признаком «эмбриональное пятно» IvP35, IvP48, IvP101) Дигаплоиды (2n = 2x = 24) культурного картофеля S. tuberosum L. получают путем опыления растений картофеля (2n = 4x = 48) пыльцой S. phureja (2n = 2x = 24) (гаплопродюсеры с маркерным признаком «эмбриональное пятно» IvP35, IvP48, IvP101) Американский селекционер Е.Н. Coe в 1959 г. выделил инбредную линию кукурузы Stok 6, которая в скрещиваниях с другими линиями кукурузы в качестве опылителя была способна давать в потомстве до 2,3% гаплоидных растений. Созданы линии-гаплопродюсеры кукурузы, которые используют в качестве материнских форм с целью получения гаплоидов от растений, пыльцой которых их опыляют [Kermicle 1969] Американский селекционер Е.Н. Coe в 1959 г. выделил инбредную линию кукурузы Stok 6, которая в скрещиваниях с другими линиями кукурузы в качестве опылителя была способна давать в потомстве до 2,3% гаплоидных растений. Созданы линии-гаплопродюсеры кукурузы, которые используют в качестве материнских форм с целью получения гаплоидов от растений, пыльцой которых их опыляют [Kermicle 1969]

Гаметоклональная изменчивость Гаметоклональная изменчивость - изменчивость растений, полученных с помощью различных методов из генеративных клеток (гамет). Основным источником гаметоклональной изменчивости является генетическое разнообразие гамет, которое возникает в процессе рекомбинации генов во время мейоза. Эта изменчивость максимальная в случае получения гаплоидов или удвоенных гаплоидов высокогетерозиготных гибридов Гаметоклональная изменчивость - изменчивость растений, полученных с помощью различных методов из генеративных клеток (гамет). Основным источником гаметоклональной изменчивости является генетическое разнообразие гамет, которое возникает в процессе рекомбинации генов во время мейоза. Эта изменчивость максимальная в случае получения гаплоидов или удвоенных гаплоидов высокогетерозиготных гибридов В случае, когда получают удвоенные гаплоиды относительно гомозиготных форм растений, основную роль играет изменчивость, вызванная культивированием клеток, и изменчивость, возникающая при удвоении хромосом у гаплоидов. При получении удвоенных гаплоидов гибридов селекционную ценность представляет, в основном, изменчивость, обусловленная рекомбинацией генов в процессе мейоза при образовании гамет. В случае, когда получают удвоенные гаплоиды относительно гомозиготных форм растений, основную роль играет изменчивость, вызванная культивированием клеток, и изменчивость, возникающая при удвоении хромосом у гаплоидов. При получении удвоенных гаплоидов гибридов селекционную ценность представляет, в основном, изменчивость, обусловленная рекомбинацией генов в процессе мейоза при образовании гамет.

Гаметоклональная изменчивость В Институте генетики и цитологии НАН Беларуси впервые было предложено использовать гаметоклональную вариацию, связанную с формированием нередуцированных гамет, для улучшения сортов картофеля – высоко гетерозиготной полиплоидной культуры, размножаемой вегетативно [Воронкова, Ермишин, 2003] В Институте генетики и цитологии НАН Беларуси впервые было предложено использовать гаметоклональную вариацию, связанную с формированием нередуцированных гамет, для улучшения сортов картофеля – высоко гетерозиготной полиплоидной культуры, размножаемой вегетативно [Воронкова, Ермишин, 2003]

Использование гаплоидов в селекции растений Ускорение получения гомозиготных линий самоопылителей (сорт пшеницы Ets Desprez во Франции был отобран среди всего 64 удвоенных гаплоидов, полученных от гибридов F1 [de Buyser et al., 1987]. Тем не менее, некоторые селекционеры рекомендуют использовать для получения удвоенных гаплоидов не гибриды F1, а F2 или F3). Ускорение получения гомозиготных линий самоопылителей (сорт пшеницы Ets Desprez во Франции был отобран среди всего 64 удвоенных гаплоидов, полученных от гибридов F1 [de Buyser et al., 1987]. Тем не менее, некоторые селекционеры рекомендуют использовать для получения удвоенных гаплоидов не гибриды F1, а F2 или F3). Сокращение сроков создания родительских гомозиготных линий перекрестноопыляемых культур и родительских линий для получения гетерозисных гибридов. Возможность получения гомозиготных линий у самонесовместимых видов. Удвоенные гаплоиды нашли применение и для повышения эффективности рекуррентного отбора. Сокращение сроков создания родительских гомозиготных линий перекрестноопыляемых культур и родительских линий для получения гетерозисных гибридов. Возможность получения гомозиготных линий у самонесовместимых видов. Удвоенные гаплоиды нашли применение и для повышения эффективности рекуррентного отбора.

Манипуляции с плоидностью исходного материала для повышения эффективности селекции полиплоидов (на примере картофеля) Получение дигаплоидов сортов картофеля; Получение дигаплоидов сортов картофеля; Гибридизация дигаплоидов с дикими диплоидными видами; Гибридизация дигаплоидов с дикими диплоидными видами; Селекция на диплоидном уровне: комбинация и концентрация желаемых генов и элиминация нежелательных; Селекция на диплоидном уровне: комбинация и концентрация желаемых генов и элиминация нежелательных; Мейотическое удвоение хромосом у отобранных генотипов (гибридизация сортов картофеля с дигаплоидами, формирующими нередуцированные гаметы) [Chase 1963; Peloquin et al. 1989]. Мейотическое удвоение хромосом у отобранных генотипов (гибридизация сортов картофеля с дигаплоидами, формирующими нередуцированные гаметы) [Chase 1963; Peloquin et al. 1989].

Эффективность использования в селекции картофеля мультиплексных родительских линий и дигаплоидов Симплекс × нуллиплекс H 1 hhh × hhhh = 1 устойчивые : 1 восприимчивые Дуплекс × нуллиплекс H 1 H 1 hh × hhhh = 5 устойчивые : 1 восприимчивые Триплекс × нуллиплекс H 1 H 1 H 1 h × hhhh = все устойчивые 4х Нуллиплекс × 2х гетерозигота (2n-гаметы) hhhh × H 1 h (2n-гаметы) = все устойчивые hhhh × H 1 h (2n-гаметы) = все устойчивые

Преимущества «диплоидной» селекции по сравнению с традиционной Благодаря более простому дисомному наследованию требуется меньший объем популяции для выделения сложных рекомбинантов, отвечающих запросам селекции Благодаря более простому дисомному наследованию требуется меньший объем популяции для выделения сложных рекомбинантов, отвечающих запросам селекции Возможность широкого использования генетического разнообразия диких диплоидных видов, интрогрессии селекционно-ценных генов диких видов в селекционный материал, расширения аллельного разнообразия S. tuberosum Возможность широкого использования генетического разнообразия диких диплоидных видов, интрогрессии селекционно-ценных генов диких видов в селекционный материал, расширения аллельного разнообразия S. tuberosum Благодаря мейотическому удвоению хромосом возможность получать более выровненные, продуктивные, экологически стабильные тетраплоидные гибридные популяции, не расщепляющиеся по комплексу признаков, отселектированных на диплоидном уровне Благодаря мейотическому удвоению хромосом возможность получать более выровненные, продуктивные, экологически стабильные тетраплоидные гибридные популяции, не расщепляющиеся по комплексу признаков, отселектированных на диплоидном уровне