ОБЩИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

В Государственный Реестр лекарственных средств включено около 300 наименований лекарственного растительного сырья и около 600 препаратов растительного происхождения. Поэтому оценка качества лекарственного растительного сырья, т.е. установление возможности применения его как лекарственного средства (лекарства), является одной из задач специалиста-провизора. Определяют подлинность и доброкачественность лекарственного растительного сырья, т.е. соответствие тем требованиям, которые предъявляет к сырью нормативный документ. Одним из важных показателей качества лекарственного растительного сырья является содержание основных биологически активных веществ (БАВ). Их определение проводится с помощью химических и физико-химических методов анализа, основанных на физических, химических и биологических свойствах БАВ.

Качественный химический анализ ' Для установления подлинности лекарственного растительного сырья используют простейшие качественные реакции и хроматографические пробы на действующие и сопутствующие вещества, основанные на их свойствах. Методика изложена в соответствующей нормативной документации на исследуемый вид сырья в разделе "Качественные реакции". По технике выполнения и характеру получаемых результатов химические реакции делят на несколько групп: 1) качественные реакции; 2) микрохимические реакции; 3) гистохимические реакции; 4) микро сублимация.

Качественные реакции выполняют на сухом сырье с такими видами сырья: Кора дуба, калины, крушины; корневища бадана, корневища и корни девясила, корни одуванчика, алтея, женьшеня, барбариса; цветки липы, семена льна, склероции спорыньи (всего по существующей НД - для 12 видов сырья). Качественные реакции.

II. В основном, качественные реакции проводят с извлечением из лекар­ственного растительного сырья. Исходя из свойств биологически активных веществ, их извлекают из сырья водой, спиртом различной концентрации или органическим растворителем, реже с добавлением щелочи или кислоты. Водное извлечение готовят из сырья, содержащего гликозиды: полисахариды, сапонины, фенологликозиды, антрагликозиды, дубильные вещества. Подкисленной водой извлекают из сырья алкалоиды в виде солей.

Большинство биологически активных веществ извлекают из сырья этиловым и метиловым спиртом различной концентрации (сердечные гликозиды, кумарины, лигнаны, флавоноиды). Если реакция достаточно специфична и чувствительна, то ее проводят с неочищенным извлечением из сырья. Например: 1) общеалкалоидные осадочные реакции; 2) реакции с раствором хлорида алюминия на флавоноиды (трава зверобоя, горца птичьего, горца перечного); 3) проба Синода на флавоноиды в цветках бессмертника; 4) реакция с раствором щелочи на антраценпроизводные (кора крушины, корни ревеня); 5) реакция с раствором железоаммонийных квасцов на дубильные вещества (кора дуба, корневища змеевика, бадана).

Часто проведению реакции мешают сопутствующие вещества (белки, амины, стерины, хлорофилл), в этом случае используют очищенное извлечение (например, из сырья, содержащего сердечные гликозиды, кумарины, алкалоиды, фенологликозиды, лигнаны). Очищают извлечение осаждением сопутствующих веществ раствором ацетата свинца и сульфата натрия, используют прием смены растворителей и метод распределительной хроматографии.

Микрохимические реакции Микрохимические реакции проводят обычно одновременно с микроскоскопическим анализом, наблюдая результаты под микроскопом; 1) на эфирное и жирное масло с раствором Судан III; 2) на одревесневшие лигнифицированные элементы с раствором флороглюцина и 25% раствором серной кислоты или конц. хлороводородной кислоты. На кору дуба (порошок) проводят реакцию с железоаммонийными квас­цами, результат реакции изучают под микроскопом.

Гистохимические реакции Гистохимические реакции - это такие реакции, с помощью которых мож­но выявить те или иные соединения непосредственно в клетках или структурах, где они локализуются. По ГФ-Х1 гистохимические реакции проводят на слизь с раствором туши в корнях алтея и семенах льна. Микросублимация. Микросублимация - непосредственное выделение из сухого растительно­го материала веществ, которые легко возгоняются при нагревании. Полученный сублимат исследуют под микроскопом, затем проводят микрохимическую ре­акцию с соответствующим реактивом (ГФ-Х1 - кора крушины).

Хроматографические методы анализа Общие положения Хроматография - процесс разделения смесей веществ, основанный на различиях в поведении разделяемых компонентов при их непрерывном перераспределении между двумя контактирующими фазами, одна из которых (твердая или жидкая) неподвижна, а другая (жидкая или газ) имеет постоянное направление движения. Каждое соединение в составе смеси веществ, обладая индивидуальны» физическими и химическими свойствами, обусловленными особенностями строения, имеет свой коэффициент распределения между подвижной и неподвижной фазой.

Хроматографические методы анализа позволяют разделить смесь веществ, различающихся коэффициентами распределения, на индивидуальные компоненты, после чего можно идентифицировать их или провести количественное определение. Хроматографические методы анализа широко применяются в фармацевтическом анализе лекарственных средств. В Государственной Фармакопее XI издания, вып. 1, в разделе «Физико-химические методы анализа» есть специальная статья «Хроматография». В ней даны подробные сведения о видах хроматографии, способах и механизмах хроматографического разделения.

Виды хроматографии. 1. Адсорбционная - в основе лежит непрерывный обмен хроматографируемым веществом между неподвижной (твердой или жидкой) и подвижной фазами, обусловленный существованием на поверхности раздела фаз динамического равновесия между процессами адсорбции и десорбции хроматографируемого вещества, растворенного в подвижной фазе. 2. Распределительная - в основе лежит процесс непрерывного перераспределения хроматографируемого вещества между двумя фазами (подвижной и неподвижной), причем это вещество растворимо в каждой из фаз. Отношение равновесных концентраций растворенного вещества в каждой из находящихся в контакте фаз в статических условиях при данной температуре является постоянной величиной и называется коэффициентом распределения (Rf).

3. Ионообменная - в основе лежит обратимая хемосорбция ионов анализируемого раствора ионогенными группами сорбента. Обратимый обмен ионами в системе сорбент- растворитель протекает в этом случае с соблюдением стехиометрических отношений. 4. Газовая хроматография, когда подвижная фаза находится в состоянии газа или пара. В фармацевтическом анализе находит применение как газожидкостная, так и газоадсорбционная хроматография. Метод газовой хроматографии применяется для анализа летучих веществ либо веществ, которые могут быть переведены с помощью специальных приемов и уст­ройств в парообразное состояние.

5. Высокоэффективная жидкостная Хроматография (ВЭЖХ) является вариантом колоночной жидкостной хроматографии, в которой подвижная фаза - элюент - проходит через заполняющий колонку сорбент с большей скоростью за счет значительного давления на входе в хроматографическую колонку. ВЭЖХ является удобным способом разделения, препаративного выделения и проведения качественного и количественного ана­лиза нелетучих термолабильных соединений как с малой, так и с большой молекулярной массой.

Применение методов хроматографии в анализе лекарственного растительного сырья В анализе лекарственных средств растительного происхождения хроматографические методы занимают особое место. В анализе лекарственного растительного сырья (ЛРС) они могут быть использованы для решения следующих задач: для качественного анализа (идентификации) ЛРС по комплексу биологически активных веществ (БАВ) или индивидуальным компонентам; для количественного определения БАВ в ЛРС (стадия очистки и выделения БАВ). Хроматография в тонком слое сорбента или тонкослойная хроматография (ТСХ) Этот метод хроматографии широко используют как для идентификации ЛРС, так и для разделения, очистки и выделения БАВ (флавоноидов, кумаринов, алкалоидов) при их количественном определении в ЛРС.

Идентификация ЛРС. ГФ XI регламентирует применение ТСХ для доказательства: - иридоидов и катехинов в коре калины (ст.4), - флаванола гиперозида в цветках (ст.8) и плодах (ст.32) боярышника, - флавон-5-гликозидов в траве хвоща полевого (ст.50), - фенологликозида салидрозида (родиолозида) и фенилпропаноида роза вина в корневищах и корнях родиолы розовой (ст. 75), - сапонинов - аралозидов в корнях аралии маньчжурской (ст. 65), - сапонинов - панаксозидов в корнях женьшеня (ст.66), - витамина К) в листьях крапивы (ст. 25).

Использование ТСХ для количественного определения БАВ. Согласно ГФ XI, метод ТСХ используют для очистки извлечения из цветков боярышника и выделения гиперозида, по количественному содержанию которого проводится оценка качества этого ЛРС.

Метод ТСХ имеет как преимущества, так и недостатки. Преимущества – в быстроте анализа и возможности детектирования веществ агрессивными проявителями при повышенных температурах (так, например, для проявления аралозидов пластинку обрабатывают 20 % - ным раствором серной кислоты и выдерживают в сушильном шкафу). К недостаткам приведенных фармакопейных методик следует отнести использование систем, включающих токсичные растворители (метанол, хлороформ и др.), дефицитных (импортных) пластинок "Silufol" и труднодоступных ГСО, необходимость насыщения камеры ( от 40 мин. до 2 час., а в некоторых случаях - до 24 час.).

Хроматография на бумаге (БХ) ГФ XI регламентирует использование метода восходящей хроматографии на бумаге (ВБХ) для идентификации листьев вахты трехлистной (ст. 19) и травы череды (ст. 45). Методы хроматографии на бумаге обладают большой чувствительностью при идентификации флавоноидов и др. фенольных соединений. Однако, для проведения ВБХ необходимы специальные громоздкие камеры, большие количества растворителей и хроматографической бумаги, а также значительные за­траты времени ( так, при анализе травы череды необходимо в течение 24 час. проводить насыщение камеры, после чего проводить разделение веществ в течение 16 час.). Эти недостатки ограничивают применение ВБХ для качественного и количественного анализа ЛРС

Методы количественного определения биологически активных веществ Методики определения количественного содержания действующих веществ описаны в соответствующей частной нормативной документации. Выбор метода зависит от физических и химических свойств БАВ. Используют гравиметрические (весовые), титриметрические (объемные и физико-химические (инструментальные) методы анализа.

Гравиметрические методы Гравиметрические (весовые) методы основаны на избирательной различной растворимости биологически активных веществ в воде и неполярных органических растворителях. Происходит выделение суммы веществ путем их осаждения или получения нерастворимых комплексных соединений с последующим установлением их постоянной массы.

Применяют для сырья, содержащего гликозиды: полисахариды (хорошо растворимы в воде и нерастворимы в крепких спиртах - осаждаются 95% этанолом); сапонины (растворимы в метиловом спирте и нерастворимы в диэтиловом эфире и ацетоне); дубильные вещества (осаждение желатином, солями тяжелых металлов или адсорбция кожным порошком; алкалоиды, выделяемые в виде солей или в виде оснований.

Методы просты в исполнении, но длительны, т.к. выделившийся осадок отделяют фильтрованием или центрифугированием, высушивают и доводят до постоянной массы. Кроме того, метод дает завышенные результаты, потому что вместе с БАВ осаждаются и сопутствующие вещества.

Но для некоторых видов сырья, например, содержащего полисахариды, этот метод наиболее специфичен, поэтому включен в статьи ГФ-Х1, вып.2 на листья подорожника большого, траву череды, слоевища ламинарии. Используется для сырья, содержащего алкалоиды: сырье безвременника, дурмана индейского, плауна-баранца. Для многих видов ЛРС проводят количественное определение экстрактив­ных веществ. Методика их определения (ГФХ1, вып.1) также основана на использовании гравиметрического метода.

Определение содержания экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье Около 1 г измельченного сырья (точная навеска), просеянного сквозь си­то с отверстиями диаметром 1 мм, помещают в коническую колбу вместимо­стью мл, прибавляют 50 мл растворителя, указанного в соответст­вующей нормативной документации на лекарственное растительное сырье, колбу закрывают пробкой, взвешивают (с погрешностью ±0,01 г) и остав­ляют на 1 ч. Затем колбу соединяют обратным холодильником, нагревают, поддерживая слабое кипение в течение 2 ч. После охлаждения колбу с содер­жимым вновь закрывают той же пробкой, взвешивают и потерю в массе вос­полняют растворителем. Содержимое колбы тщательно взбалтывают и фильт­руют через сухой бумажный фильтр в сухую колбу вместимостью мл.

25 мл фильтрата пипеткой переносят в предварительно высушенную при температуре °С до постоянной массы и точно взвешенную фарфоровую чашку диаметром 79 см и выпаривают на водяной бане досуха. Чашку с остатком сушат при температуре ° С до постоянной массы, затем охлаждают в течение 30 мин в эксикаторе, на дне которого находится безводный хлорид кальция, и немедленно взвешивают. Содержание экстрактивных веществ в процентах в пересчете на абсолютно сухое сырье

Титриметрические методы Титриметрические (объемные) методы основаны на химических свойствах биологически активных веществ: 1. На их способности легко окисляться; - перманганатом калия (дубильные вещества); - раствором йода (простые фенольные соединения - арбутин); - 2,6-дихлорфенолиндофеолятом натрия (аскорбиновая кислота).

2. На основных свойствах основаны титриметрические методы определения алкалоидов. Алкалоиды ведут себя как основания и могут быть определены путем: - прямого титрования (сырье анабазиса, софоры толстоплодной, чилибухи; - обратного титрования (листья белены, дурмана, красавки; трава термопсиса, корневища с корнями чемерицы) растворами кислот. Слабые основания определяют методом кислотно- основного титрования в неводных средах, где титрантом служит хлорная кислота. Точку эквивалентности устанавливают по индикатору или потенциометрически (ГФ-Х1 - трава чистотела - метод неводного потенциометрического титрования).

Физико-химические методы Наиболее точны и высокочувствительны фотометрические методы (колориметрия и спектрофотометрия), основанные на измерении количества света, поглощенного веществом, суммой веществ или комплексом вещества видимой, ультрафиолетовой и инфракрасной области спектра. Используют фотометрические методы для определения почти всех групп биологически активных веществ (сердечные гликозиды, экдистероны, сапонины, кумарины, хромоны, лигнаны, флавоноиды, антраценпроизводные, дубильные вещества, алкалоиды, каротиноиды).

Фотоэлектроколориметрические методы основаны на измерении степени поглощения немонохроматического (полихроматического) света на довольно широком участке спектра окрашенных растворов с помощью фотоэлектроколориметра. Для получения окрашенных соединений используют реактивы, дающие яркие, устойчивые окраски: на флавоноиды, кумарины, фенологликозиды проводят реакцию образования азокрасителя с диазотированными сульфаниламидами (ГФ-Х1 - листья вахты, корневища и корни родиолы розовой). Для анализа алкалоидов используют частные цветные реакции, основанные на окислении, конденсации и дегидратации алкалоидов концентрированными кислотами (коробочки мака, трава мачка желтого).

Антраценпроизводные дают вишнево-красное окрашивание со щелочами (кора крушины, корни ревеня, корневища и корни марены красильной). Спектрофотометрические методы основаны на способности веществ или их окрашенных продуктов реакции избирательно поглощать монохроматический свет в определенной области спектра. Такими свойствами обладают флавоноиды, кумарины, антраценпроизводные, сапонины, индивидуальные алка­лоиды, экдистероны. Измерение проводят с помощью спектрофотометра.

Для большинства видов сырья, содержащих флавоноиды, измеряют: - собственное поглощение суммы флавоноидов (ГФ-Х1 - цветки бессмертника, цветки пижмы); - поглощение окрашенного комплекса с алюминия хлоридом (трава горца перечного, горца птичьего, зверобоя, листья сумаха, скумпии). Для сырья, содержащего антраценпроизводные, используют реакцию со щелочью (листья сенны). Для сырья, содержащего фенологликозиды, используют реакцию диазотирования (корневища и корни родиолы розовой).

Наиболее точными являются хроматоспектрофотометрические методы основанные на разделении веществ с помощью хроматографии с последующим их определением спектрофотометрически. Можно определять количественное содержание как суммы веществ, так и индивидуальные вещества. Реже для анализа лекарственного растительного сырья применяется флюорометрия, полярография, денситометрия, амперометрия, кондуктометрия.