ОНТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЧАСЫ Молекулярно-генетический механизм (гипотеза) Институт геронтологии АМН Украины Лаборатория математического моделирования процессов старения доктор мед. наук А.В. Писарук

«Часы» старения – метафора или реальность? «Часы» старения - популярный образ (метафора) в научно-популярных статьях и фильмах о старении. Возможно, действительно существуют биологические часы, отсчитывающие время нашей жизни?

Основные группы теорий старения Накопление повреждений ДНК и белков (износ) Теория соматических мутаций. Свободнорадикальная теория Д. Хармана и Н.М. Эмануэля ( ). Теория перекрестных «сшивок» макромолекул. Программа старения Теория пролиферативного лимита клетки (Л. Хейфлик, 1961; А.М. Оловников, 1971). Гипотеза френоптоза В.П.Скулачёва (1997). Программа развития (Онтогенетические часы) Элевационная теория В.М. Дильмана (1972). Редумерная гипотеза А.М. Оловникова (2003).

Кандидаты на роль «часов» старения Предполагаемые "часы" старения Теория, гипотеза Гипоталамус Элевационная теория В.М. Дильмана Супрахиазматические ядра Гипотеза френоптоза В.П. Скулачёва Эпифиз Гипотеза «хронометра жизни» В.Н. Анисимова ДНК (теломеры)Гипотеза маргинотомии А.М. Оловникова ДНК (ряду меры)Редумерная гипотеза А.М. Оловникова

Определение понятия «онтогенетические часы» Онтогенетические часы – гипотетический механизм отсчета времени жизни организма с целью управления онтогенезом. Для выполнения этой функции онтогенетические часы должны запоминать число циклов своей работы и изменять экспрессию определенных генов через заданное число циклов. Термин «онтогенетические часы» связывают с элевационной теорией В.М. Дильмана. Он называл их «Большие Биологические Часы». Это понятие использовали Ф.Ф.Северин и В.П.Скулачёв в статье «Запрограммированная клеточная смерть как мишень борьбы со старением // Успехи геронтологии 2009, 1.»

Гипотеза френоптоза В.П. Скулачёва Онтогенетические часы Повышение уровня АФК в митохондриях Преобладание апоптоза над пролиферацией клеток Уменьшение количества клеток в органах Ослабление функционирования органов

Зачем организму онтогенетические часы? Организация во времени процессов эмбрионального развития. Инициация очередной стадии развития у организмов с метаморфозом. Запуск процесса полового созревания и выключение репродуктивной функции через заданное время. Включение «программы смерти» (у некоторых видов) и возможно, процесса старения. Запуск процесса самоликвидации клетки (апоптоза) через заданное время.

Факты, свидетельствующие о существовании единой программы онтогенеза Корреляция периода развития и продолжительности жизни для 4 таксонов.

Зависимость продолжительности жизни у Drosophila melanogaster от скорости развития личинки при изменении температуры в период развития (Lints, 1971). Возможно, существует единая программа развития и старения (М. Лемб, Биология старения, 1980)

Временная организация событий онтогенеза дрозофилы с помощью гормона экдизона

Временная организация событий онтогенеза у женщин с помощью эстрогенов Время полового созревания и менопауза могут задаваться онтогенетическими часами.

Экспрессия генов закономерно изменяется в онтогенезе

Пример изменения экспрессии генов в онтогенезе человека Карта активности генов маркеров воспаления в зависимости от возраста. Зеленым обозначены гены с подавленной экспрессией, а красным с повышенной экспрессией. Сверху приведен возраст доноров. Показано, что работа некоторых генов взрослой дрозофилы (в постмитотических клетках) разворачивается по строгому графику. Причем, при изменении продолжительность жизни исследуемой линии в три раза, адекватно меняются и графики работы этих генов. Helfand S.L. et al. Temporal Patterns of Gene-Expression in the Antenna of the Adult Drosophila-Melanogaster // Genetics V N 2. - P

Старение – следствие выполнения программы развития (элевационная теория старения В.М. Дильмана) Главная причина старения – это возрастное снижение чувствительности гипоталамуса к регуляторным гормональным сигналам обратной связи (рост порога гипоталамуса). Cтарение является следствием потери контроля за образованием гормонов, в результате чего их вырабатывается либо слишком много, либо слишком мало, что приводит к нарушению гомеостаза. Старение не запрограммировано, а является побочным продуктом реализации генетической программы развития и поэтому старение возникает с закономерностью, свойственной генетической программе. В.М. Дильман,

Схема реализации программы постэмбрионального развития и старения по Дильману, 1971 Снижение чувствительности гипоталамуса к гормональным регуляторным сигналам обратной связи (рост порога гипоталамуса) Увеличение секреции гипофизом тропных гормонов (СТГ, АКТГ, ТТГ, ФСГ): рост организма и половое созревание. «Обрыв» обратной связи в репродуктивной системе (эстрогены – ФСГ): развитие менопаузы. Возраст, лет Рост продукции кортизола: развитие метаболического синдрома, иммунодепрессии, канкрофилии. (возраст-зависимая патология)

Принципиальная схема онтогенетических часов Внешняя среда Внутренняя среда

Циркадианные часы – возможная кандидатура на роль онтогенетических часов Есть в каждой клетке всех организмов. «Показывают» время суток. Служат для адаптации организма к смене дня и ночи. Синхронизируются внешним ритмом смены дня и ночи. Период колебаний равен суткам и не зависит от температуры тела. Есть центральный водитель ритма (супрахиазматические ядра), синхронизирующий все клеточные часы. Изучен молекулярно-генетический механизм (часовые гены, белки).

Молекулярно-генетический механизм простейших циркадианных часов Ядро клетки Цитоплазма мРНК «Часовой» ген «Часовой» белок распад Колебания концентрации «часового» белка

Гипотеза циркадианного хронометра жизни (Оловников А.М., Скулачёв В.П., Анисимов В.Н.) В основе онтогенетических часов лежат циркадианные часы. Циркадианные часы запоминают число прожитых дней. Через заданное число дней эти часы изменяют экспрессию генов для инициации очередной стадии развития.

Механизм онтогенетических часов по Оловникову « Редусомная гипотеза старения и контроля биологического времени в индивидуальном развитии // Биохимия. 2003» Циркадианный (инфрадианный) биологический ритм Укорочение хронометр (хроно-ДНК) в каждом цикле биологического ритма Изменения экспрессии генов Смена стадий онтогенеза

Кривые выживаемости Drosophila melanogaster при удлинении суток в два раза (24 ч свет, 24 ч темнота) (Войтенко В.П., Вайсерман А.М., Кошель Н.М., Тимченко А.Н., и др г.) Проверка гипотезы циркадианного хронометра жизни Изменение периода циркадианных часов в n раз должно изменять скорость развития и продолжительность жизни в n раз.

Зависимость продолжительности жизни дрозофил от температуры среды (Мурадян Х.К., Тимченко А.Н., 1982)

Ограничение калорийности рациона продлевает жизнь В 1939 году Клив Мак Кей открыл, что умеренное ограничение калорийности питания, не приводящее к голоданию, продлевает жизнь крыс.

Циркадианные часы не подходят для управления онтогенезом? Скорость развития и продолжительность жизни пойкилотермных организмов значительно зависят от температуры среды. Скорость развития и продолжительность жизни теплокровных организмов зависят от калорийности питания. Ход циркадианных часов не зависит от температуры и питания. Управление онтогенезом с помощью циркадианных часов – это управление без обратной связи, не учитывающее условия среды.

Автономный молекулярно-генетический осциллятор – основа онтогенетических часов Молекулярное устройство осциллятора онтогенетических часов может быть подобно циркадианным часам. В отличие от циркадианных часов этот осциллятор: не должен синхронизируется светом с природным циркадным ритмом смены дня и ночи; период колебаний должен зависеть от температуры тела – увеличиваться при её снижении и уменьшаться при росте температуры. Такой осциллятор будет отсчитывать не физическое, а биологическое время, что позволит ему более адаптивно управлять развитием организма. Запоминание времени жизни организма может происходить путем укорочения хроно-ДНК в каждом цикле колебаний осциллятора.

Структура хроно-ДНК – программы развития организма Хроно-ДНК состоит из повторяющихся последовательностей нуклеотидов (τ-сегментов) и темпоральных (регуляторных) генов, контролирующих экспрессию хромосомных генов. Длина хроно-ДНК (без темпоральных генов) = 4 (нуклеотида) х 365 (дней в году) х 100 (лет) = 146 тыс. пар нуклеотидов (0,2% от суммарной длины негенной ДНК человека).

Некодирующая ДНК может содержать хроно-ДНК Некодирующая ДНК в хромосомах составляет 95 % общей длины ДНК. Остальная ДНК – структурные гены, кодирующие белки. 50 % некодирующей ДНК содержит повторы последовательностей нуклеотидов разной длины. Обнаружены участки некодирующей ДНК, содержащие короткие (от 2 нуклеотидов) тандемные повторы нуклеотидов (short tandem repeat, STR) - повтор двух или более пар непосредственно примыкающих друг к другу нуклеотидов в последовательности ДНК. Например, в локусе DYS391 имеется 12 повторов из четырех нуклеотидов... TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA...

Темпоральные гены могут кодировать регуляторные микро-РНК Самыми маленькими регуляторными РНК являются siRNA, содержащие всего пар нуклеотидов. siRNA способны подавлять транскрипцию генов, содержащих гомологичные siRNA последовательности. Это явление было названо транскрипционным сайленсингом генов. siRNA направляют модификации гистонов и метилирование ДНК, что приводит к образованию гетерохроматина и репрессии транскрипции.

Молекулярный механизм укорочения хроно-ДНК Биофизический (по Оловникову)Ферментативный (эндонуклеазный) «Механический разрыв хронометрной ДНК, не выдерживающей напора транскрипционной машины, побуждаемой к суперскоростному движению вдоль матрицы пиком гормонального Т-ритма. При этом гормональный пик должен быть коротким (10 мин) и иметь специфическую последовательность колебаний концентрации гормона.» Подобный механизм не известен. Используется известный механизм «разрезания» ДНК в определённой точке с помощью фермента эндонуклеазы (рестриктазы). Место разрезания определяется сайтом связывания (последовательностью из 4-8 нуклеотидов). Используется рестриктаза II типа, состоящая из двух субъединиц (белков).

Эндонуклеаза рестрикции (рестриктаза) – возможный элемент онтогенетических часов Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы (от лат. restrictio ограничение) группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот. Рестриктаза узнаёт определённый участок ДНК длиной от четырёх пар нуклеотидов и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его. Рестриктазы II типа узнают определённую последовательность ДНК и разрезают двойную спираль ДНК в определённой фиксированной точке внутри этой последовательности. Состоят из 2-х белковых субъединиц.

Схема гипотетического механизма укорочения хроно-ДНК с помощью рестриктазы Хроно-ДНК (τ-сегменты) Субъединицы рестриктазы Распад комплекса (τ-сегмент+рестриктаза) Укороченная хроно-ДНК Для отсчета времени жизни организма необходимо однократное обрезание концевого сегмента хроно-ДНК в каждом цикле онтогенетических часов. Для этого субъединицы рестриктазы должны появляться поочередно. А-белокВ-белок

Схема гипотетического механизма укорочения хроно-ДНК с помощью рестриктазы Хроно-ДНК (τ-сегменты) Субъединицы рестриктазы Для отсчета времени жизни организма необходимо однократное отрезание концевого сегмента хроно-ДНК в каждом цикле онтогенетических часов. Для этого субъединицы рестриктазы должны появляться поочередно. А-белок В-белок

Молекулярно-генетический механизм осциллятора онтогенетических часов Ядро клетки Цитоплазма мРНК В-ген В-белок мРНК А-ген А-белок Осциллятор онтогенетических часов состоит из 2-х спаренных осцилляторов (типа циркадианных), соединенных положительными и отрицательными связями, обеспечивающими поочередный синтез А и В белков.

Блок-схема осциллятора онтогенетических часов [A], [B] – концентрации А и В белка; VsmA, VsmВ – скорости синтеза мРНК для белков А и В; [mA], [mB] – концентрации мРНК для белков А и В; VsA, VsB – скорости синтеза белков А и В. Ядро [B] [A] Цитоплазма В-ген А-ген V s mA Vs mВVs mВ [mA] [mB] VsAVsA VsBVsB [B] [A] РИБОСОМАРИБОСОМА

Математическая модель онтогенетических часов (основана на модели циркадианных часов Scheper T., et al., 1999 ) [mA], [mB] - концентраци мРНК для А и В белков; [A], [B] - концентрации А и В белков; k1 константа транскрипции (1,0 нмоль/ч); k2 константа скорости распада мРНК (0,26 нмоль/лч); k3 константа трансляции (9,0 нмоль/лч); k4 константа скорости распада А и В белков (0,3 нмоль/лч); n - коэффициент Хилла (2); m константа нелинейности (3); временная задержка (4 ч).

Расчётная динамика концентраций А и В белков в клетке (математическая модель) Период колебаний осциллятора равен 24,4 часам. При изменении параметров системы период может как удлиняться, так и укорачиваться.

Отличия предложенной гипотезы онтогенетических часов от редумерной гипотезы А.М. Оловникова Редумерная гипотеза А.М.Оловникова Гипотеза «онтогенетических часов» В основе механизма отсчета времени жизни лежит биологический Т-ритм, синхронизированный с природным ритмом (циркадный, лунный). Измеряется физическое время. В основе механизма отсчета времени жизни лежит автономный клеточный молекулярно- генетический осциллятор. Измеряется биологическое время. Механизм укорочения хронометры связан со сверхскоростной транскрипцией («скраптингом») под влиянием гормонального сигнала Т-ритма. Механизм укорочения хроно-ДНК связан со сборкой на ее концевом сегменте особой рестриктазы из двух субъединиц, последовательно появляющихся в ядре клетки.

Как объясняет гипотеза онтогенетических часов основные факты о старении? Факты Объяснение Видовые и индивидуальные различия продолжительности жизни. Различная длина хроно-ДНК и (или) различный период колебаний онтогенетических часов. Зависимость продолжительности жизни от длительности развития. Единая программа онтогенеза, реализующаяся с помощью онтогенетических часов. Зависимость продолжительности жизни от температуры и калорийности питания. Изменение периода колебаний онтогенетических часов.

Экспериментальная проверка гипотезы онтогенетических часов Методы Ожидаемые результаты Остановка онтогенетических часов на разных стадиях развития Остановка развития. Замедление (остановка) старения. Изменение периода колебаний онтогенетических часов При увеличении периода – замедление онтогенеза, при уменьшении периода – ускорение развития. Поиск периодических автономных колебаний, не синхронизированных с природными ритмами и изменяющими свой период в зависимости от температуры среды (у пойкилотермных) и калорийности питания. Поиск молекулярных компонентов онтогенетических часов в клетках.

Возможный случай остановки онтогенетических часов у человека A case study of disorganized development and its possible relevance to genetic determinants of aging Richard F. Walker at al. // Mech Ageing Dev May;130(5): Epub 2009 Feb 24. Настоящей сенсацией стала история об одной из дочек Мелани и Говарда Гринбергов из американского города Балтимора. В их семье есть еще трое детей - 22, 19 и 13 лет. Все девочки развиваются нормально. А Брук, которой исполнилось уже 17 лет, словно застряла в 11- месячном возрасте. И уже 16 лет не меняется внешне. У нее не обнаружен ни один из известных генетических синдромов или хромосомная аномалия, которые могли бы объяснить, почему она не стареет.

Часы отсчитывают дни, Неумолим их ход… А если их остановить, То старость не придёт?