Лекция 2 Генетическая система пластид Методы обнаружения ДНК в пластидах (краткая история) Параметры пластидной ДНК. Нуклеоиды – пластидные ядра Первичная структура ДНК пластид Генетическая компетентность пластид

Клетка мезофилла (65 μm) Превращение меристематической клетки ячменя с 10 про пластидами диаметром 1 μm в мезофильную клетку листа с 65 хлоропластами диаметром 6-8 μm Клетка меристемы ( 15μm ) Как формируются ткани растений, содержащие хлоропласты?

хромопласт хлоропласт лейкопласт про пластида Формирование и взаимопревращение пластид

Алейропласт Амилопласт Элайопласт Лейкопласт Хлоропласт Хромопласт запасание фотосинтез окрашивание Пропластида Этиопласт

В конце 18 века итальянец Компаретти: «пластиды – гранулы растительной клетки» год Нэгели наблюдал деление пластид у водоросли нателла 1858 г. Трекул первый зарисовал пластиды Термин пластиды появился в конце 19 века Предыстория…

История обнаружения ДНК в пластидах Исследование изолированных пластид Исследование изолированных пластид 1938 – осаждение хлоропластов из листьев шпината, выделено вещество нуклеопротеинов ой природы. Начало 50-х годов: в этой фракции были найдены азотистые основания ДНК и РНК в хлоропластах – % от сухого веса пластид

РНК была обнаружена при окраске пиронином в хромопластах моркови и при окраске азуром в этиопластах кукурузы Окраска на ДНК по Фельгену не всегда давала положительный результат Таким образом, гистохимический ДНК не всегда обнаруживалась, что привело к поиску других, более чувствительных методов Гистохимия Красители: пиронин, метиловый зеленый, азур, краситель Фельгена

1957 г Электронная микроскопия Рут Сэджер у хламидомонады увидела рибосомоподобные частицы диаметром А, позднее они были найдены в хлоропластах высших растений и у других водорослей При предварительной обработке РНКазой частицы не выявлялись

1958 г. Авторадиография – показано включение в пластиды Н3- тимидина (водоросли Acetabularia), через несколько лет включение Н3- тимидина - в пластиды табака Тритий включается только в пластиды из молодых листьев 1961 г. - Совместное применение ЭМ и АВТР (меченые основания) помогло показать синтез ДНК в про пластидах папоротника, а также синтез ДНК+РНК в этиопластах кукурузы

1961 г. Рис и Плаут обнаружили в хлоропластах хламидомонады фибриллы диаметром А, исчезавшие при обработке ДНКазой и удивительно напоминавшие бактериальную хромосому. Подобные нити были найдены позднее и у других растений (1962) Электронная микроскопия привела к обнаружению в пластидах ДНК в виде фибрилл и РНК в виде рибосомоподобных гранул

Blue indicates DNA and red indicates the chlorophyll autofluorescence on the thylakoid. cpn, chloroplast nucleoids; mtn, mitochondrial nucleoids; n, nuclei. Bar in (F) = 3 µm for (A) to (F). Нуклеоиды хлоропластов – пластидные «ядра» Фазово-контрастные изображения Целые клетки Изолированные пластиды Субфракция хп-нуклеоидов DAPI-окраска ДНК Аутофлуоресценция хлорофилла Cyanidioschyzon merolae – красная водоросль

По крайней мере у некоторых низших водорослей ДНК образует нуклеоиды с помощью гистоноподобных белков DAPI-окраска Одна и та же клетка Флуоресцентная иммунолокализация белка HC в нуклеоидах пластид у

Особенности организации растительных нуклеоидов (часть 1) 1. Нуклеоиды – это несколько копий пластидной ДНК, плотно упакованных в большие нуклеопротеиновые частицы 2. Нуклеоиды можно видеть во флуоресцентном микроскопе после окрашивания тканей ДНК-интеркалирующими флуоресцентными красителями, например DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) 3.Число, форма и размеры нуклеоидов варьируют в зависимости от вида: - число нуклеоидов в клетке обычно 5-10 (может быть от 1 до 100) - у водорослей и высших растений описано 5 вариантов формы нуклеотидов – от сферической до кольцеобразной; 4. Количество пластомных копий на нуклеоид зависит от вида растений и от стадии дифференцировки пластид: - пропластиды часто содержат только один нуклеоид; - зрелые пластиды могут содержать более нуклеоидов; 5. Нуклеоид и, вероятнее всего, каждая отдельная ДНК-копия, связаны с мембранами пластид: с тилакоидной мембраной и с внутренней мембраной пластиды;

Кольцевые нуклеоиды пластид одноклеточной водоросли Heterosigma akashiwo токсическая водоросль, распространена повсеместно в прибрежной зоне

Особенности организации растительных нуклеоидов (часть 2) 6. Изолированные нуклеоиды сохраняют транскрипционную активность in vitro: это свидетельствует о том, что транскрипционный аппарат тесно связан с ДНК пластид; 7. Совершенно неясно, как контролируется число геномных копий, которые «упаковываются» в один нуклеоид; 8. Обнаружено несколько ДНК-связывающих нуклеотидных белков, самый изученный Н1 р - гистоноподобный 9. Число нуклеоидов на клетку определяется ядерными генами; признак может мутировать В норме у Chlamydomonas ~ 7 нуклеоидов Получены мутанты c резко увеличенным или уменьшенным числом нуклеоидов: нуклеоидов 1 нуклеоид мутант MOC

(A) Линейная молекула хпДНК. (B) Два мономера хпДНК – линейный и кольцевой (C) Димер хпДНК (180 µm). (D) Линейные молекулы хпДНК Хлоропластная ДНК хламидомонады

Каковы молекулы? Каковы молекулы? Хлоропластные ДНК чаще всего - кольцевые (эвглена, 1971). Длина кольца – от 36 до 62 микрон Длина кольца постоянна для каждого вида растений, обычно мкм. Обнаруживаются также линейные молекулы, димеры, сцепленные димеры У табака и арабидопсиса обнаружены мультимеры: 6-10 геномных копий Сколько их в клетке ? Копий пластидной ДНК на органеллу Пластид в клетке несколько сот Число пластидных геномов на клетку – от 2000 до В хромопластах геномных копий намного меньше В онтогенезе число пластидных ДНК копий может меняться в раз.

Растение % от тотальной ДНК Геномов на клетку Геномов на пластиду Горох Соя Шпинат Свекла Картофель Пшеница Максимальные уровни хлоропластной ДНК в листьях на свету

Черная сосна п.н. SSC IR 495 LSC Epifagus virginiana п.н. SSC 4759 IR IR LSC Сравнение пластомов некоторых высших растений, для которых установлена полная нуклеотидная последовательность Растение-паразит (не фото синтезирует)

кориандр Вариации размеров однокопийных районов и инвертированных повторов хлоропластных ДНК покрытосеменных: Pelargonium hortorum, Spinacia oleracea, Coriandrum sativum

1976 г. – первая физическая карта хлоропластного генома кукурузы Физическая карта дает представление о размере генома и потенциальной кодирующей способности, но не о конкретных генах

Хлоропластная ДНК Генетическая карта пластидной ДНК табака год

Пластидная ДНК сосны

Пластидная ДНК Chlamydomonas Кольцо показывает гены и ORFs неизвестной функции. Наружное кольцо – гены с известной или предполагаемой функцией

Пластидный геном водоросли Nephroselmis olivacea содержит больше всего генов – 127 гены ycf81 и ftsI раньше обнаруживались только у бактерий 7 генов хп ДНКNephroselmis есть только у этой водоросли: это РНК компонент РНКазы P (rnpB), ген trnS(cga), 5 белок-кодирующих генов из них

Наземные растения Водоросли Фотоcин тетки b Epifagus Chlorella EuglenaOdontellaPorphyraCyanelle Всего 105~ Генетическая система 59~ Фотосинтез Rbc- тилакоиды NADH- дегидрогеназы Фикобилисомы 31~ Биосинтез и прочие гены 2~ Перечень известных генов некоторых отсеквенированных геномов

30S субъединица (12 генов из 24 – в пластидной ДНК) rps2 rps3 rps4 rps7 rps8 rps11 rps12 i rps14 rps15 rps16 i rps18 rps19 50S субъединица (9 генов из 34 – в пластидной ДНК) rpl2 I rpl14 rpl16 i rpl20 rpl21 rpl22 rpl23 rpl32 rpl33 rpl36 Гены белков рибосом пластид !Гены рибосомальных белков пластид собраны в опероны L23 L2 S19 L22 S3 L16 L14 S8 IF1 L36 S11 α 12 генов пластид собраны в самый большой хлоропластный кластер ctL23 Только немногие пластидные гены транскрибируются моноцистронной (например, psba, rbcL), все остальные по полицистронному типу (как у прокариот)

За 20 лет ( ) полностью секвенирование 58 пластидных геномов: 40 – семенных растений 5 – зеленых водорослей 4 - красных водорослей 9 – других организмов (водоросли, токсоплазмы и пр.)

Вид Обший размер генома, т.п.н. Т РНК гены Р РНК гены Белок- кодирующие гены Неизвест- ные ORFs Marchantia polymorpha (1986) Nicotiana tabacum (1986) Oryza sativa (1989) псевд Zea mays (1995) Epifagus virginiana (1992) псевд 421 Pinus thunbergii Euglena gracilis (1993) более 10 Porphyra purpurea (1995) Cyanophora paradoxa (1995) Odontella sinensis (1995) Генетическая компетентность пластид разных систематических групп тРНК гены: (17) рРНК гены: 3-5 Белок-кодирующие гены:

E. сoliхлоропласт 4 субъединицы а 2 ββ' rpoA rpoB rpoC 5 субъединиц а 2 ββ'β'' rpoA rpoB rpoC1 rpoC2 N и С- части β'- субъединицы кодируются разными генами РНК-полимераза Гены rpo E.coli гибридизуются с ДНК пластид, что помогло обнаружить и локализовать rpo гены в хпДНК РНК-полимераза пластид кодируется четырьмя генами rpo

РДФК (RBC) - основной белок стромы хлоропластов состоит из одинаковых 8 больших и 8 малых субъединиц. Белок кодируется двумя геномами: SS – малая субъединица kD LS – большая субъединица kD Ядерный rbcS Хлоропластный rbcL У бурых и красных водорослей оба гена кодируются пластидной ДНК Гены мембран тилакоидов: гены ФС1; (5 генов psa) гены ФС2; (12 генов psb). ген psbА один из наиболее изученных, так как связывается с атразином и др. гербицидами. цитохромный комплекс b/f (5 из 7 кодируются хп геномом) ATФ-синтеза (два комплекса, 5 и 4 субъединицы; хп геном кодирует по 3 субъединицы каждого комплекса). Гены NADH- дегидрогеназы Выявлены участки, кодирующие посл-ти, гомологичные белкам дыхат. цепи митохондрий. Эти гены активно транскрибируются, но роль их в хп пока неясна. У хп водорослей эти гены не найдены!

Итак, за 50 лет: построены полные карты нуклеотидных последовательностей хлоропластной ДНК для 88 разных в систематическом отношении групп растений ( год назад – 58!) идентифицировано на этих картах множество генов, относящихся к разным функциональным группам; выяснены особенности группировки этих генов в кластеры.