Ферменты особенности биокатализа классификация строение взаимодействие с субстратом ферментативная кинетика ингибирование ферменты в биотехнологии

Ферменты (энзимы) - биокатализаторы метаболических реакций Особенности ферментов: высокая эффективность специфичность способность к регуляции

Внутриклеточное распределение ферментов В клетке может содержаться до 1000 ферментов Ядерные ферменты катализируют биосинтез НК Ферменты энергетического обмена действуют в митохондриях Ферменты, комплектующие белки - в аппарате Гольджи Гидролитические ферменты - в лизосомах Ферменты, защищающие клетку от чужеродных химических веществ, - в эндоплазматическом ретикулуме

Класс Важнейшие подклассы Тип реакции 1.Оксидо- редуктазы А red + B ox A ox + B red Дегидрогеназы, оксидазы, пероксидазы, редуктазы 2.Транс- феразы А-В + С А + В-С С 1 -трансферазы, амино-, фосфо-, гликозил- трансферазы 3. Гидро- лазы А-В + Н 2 О А-Н + В-ОН Эстеразы, гликозидазы, пептидазы, амидазы 4. Лиазы (синтазы) А + ВА-В С-С-лиазы, С-О -лиазы, С-N- лиазы, С-S- лиазы 5. Изомеразы А изо-А Эпимеразы, цис-транс- изомеразы 6. Лигазы (синтетазы) А + В А-В NTP NMP + PP i C-C-лигазы, С-О-лигазы, С-N- лигазы, С-S-лигазы

1. Оксидоредуктазы 1.1. Ферменты, действующие на группу СН-ОН R-CH 2 -OH + NAD + R-CH=O + NADH + H Ферменты, действующие на группу СН-NН 2 CH 3 -CH-COOH + NAD + + H 2 O CH 3 -C-COOH + NADH + H + + NH 3 NH 2 O ALA PYR

2. Трансферазы 2.1. Ацилтрансферазы СH 3 -CO-CoA + HO-CH 2 -СН 2 -N(CH 3 ) 3 CH 3 CO-O-CH 2 -СН 2 -N(CH 3 ) 3 + CoA Ацетил-кофермент-А + + Холин Ацетилхолин Кофермент-А 2.2. Фосфотрансферазы переносят фосфатные группы

3. Гидролазы 3.1. Ферменты, действующие на сложноэфирные связи - э с т е р а з ы CH 3 CO-O-CH 2 -N(CH 3 ) 3 + Н 2 О CH 3 CO-OН + НO-CH 2 -N(CH 3 ) Ацетилхолин Холин Уксусная кислота 3.2. Пептидазы расщепляют пептидные связи; 3.3. Гликозидазы расщепляют гликозидные связи

4. Лиазы - ферменты, отщепляющие группы от субстратов по негидролитическому механизму HOOC-CH-CH-COOH HOOC-C=C-COOH + H 2 O OH H H MAL FUM Н

5. Изомеразы CH=O OH CH 2 -O-PO 3 H 2 CH 2 -OH CH 2 -O-PO 3 H 2 C=O D-глицеральдегид- -3-фосфат Дигидроксиацетон- фосфат

6. Лигазы - ферменты, катализирующие образование связей (от лат. лигаре - связывать) 6.1. Образование связей С-N HOOC-CH-(CH 2 ) 2 -COOH + ATP + NH 3 HOOC-CH-(CH 2 ) 2 -CO-NH 2 + ADP + H 3 PO 4 NH 2 GLU GLN

6.2. Образование связей С-C CH 3 -CO-CoA + CO 2 + ATP HOOC-CH 2 -CO-CoA + ADP Ацетил-кофермент-А Малонил-кофермент-А

Белок~кофактор белок кофактор Связь может быть ковалентной или нековалентной Холофермент ( оптимальная каталитическая активность) Апофермент; неактивен или менее активен ( Неорганический ион или органическое соединение Некоторые ферменты требуют два или три различных кофактора Строение ферментов

Неорганические кофакторы - ионы металлов : Zn 2+, Mg 2+, Mn 2+, Fe 2+, Cu 2+, K +, Na + Типы кофакторов Органические кофакторы - коферменты, большая часть образуется из витаминов

Витамины Аскорбиновая кислота - витамин С

Витамины Тиамин - витамин В 1

Витамины Никотиновая кислота - витамин РР

2 H + H + NAD H NADH + H + R-CH 2 -OH R-CH=O - 2 H Окислительно-восстановительные коферменты:

Витамины Рибофлавин - витамин В 2 FAD

FAD + 2 H FADH 2 R-CH 2 -CH 2 -R` R-C=C-R` H H - 2 H Окислительно-восстановительные коферменты:

Катализатор снижает энергию активации, не влияя на положение равновесия Ферменты ускоряют реакции по крайней мере в миллион раз !!

События в активном центре Высокая избирательность действия фермента обеспечивается тем, что субстрат связывается в активном центре фермента в нескольких точках Активный центр располагается в углублении (нише) поверхности фермента и имеет комплементарную субстрату конфигурацию

Секрет высокой каталитической эффективности ферментов сближение и необходимая ориентация удаление молекул воды в активном центре кислотно-основной катализ координационный катализ

Связывание фермента с субстратом происходит в активном центре В активном центре участвуют аминокислотные остатки, имеющие химически активные боковые цепи: Cys, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg, Tyr, His

Высокая избирательность действия фермента обеспечивается тем, что субстрат связывается в активном центре фермента в нескольких точках Типы взаимодействия «фермент - субстрат» «Ключ - замок»«Перчатка - рука» Индуцированное соответствие Жесткая матрица Э. Фишер Г. Кошланд

Сближение и ориентация субстрата по отношению к каталитической группе в активном центре фермента Неправильная ориентация, неправильное сближение Правильное сближение, неправильная ориентация Правильное сближение, правильная ориентация

Специфичность действия ферментов группа связь группа А Б ББ Б В ВВ В ВВВВ Реакционная специфичность Субстратная специфичность А высокая высокая Б высокая низкая В низкая низкая

Гидролиз пептидной связи

Zn 2+ Структура карбоксипептидазы А - фермента, гидролизующегопептидную связь со стороны С-концевой кислоты

Напряжение и деформация: индуцированное соответствие Структура карбокси- пептидазы А меняется при связывании субстрата 1. Фермент без субстрата 2. Фермент-субстратный комплекс субстрат Glu-270 Arg-145 Tyr-248

Пространственное расположение пептида в активном центре карбоксипептидазы А

Механизм действия карбоксипептидазы A события в активном центре Общий кислотно-основной катализ Координационный катализ Ионное взаимодействие Неполярный карман

На поверхности катализатора находится глубокий карман, помогающий связыванию субстрата путем взаимодействия с R-группой С-концевой кислоты С-конец - тирозин (Tyr)

CH 3 -CH 2 -OH CH 3 -CH=O NAD + NADH + H + Окисление этанола алкогольдегидрогеназой ( кофермент - никотинамидаденин- динуклеотид - NАD+ ) алкогольдегидрогеназа

События в активном центре алкогольдегидрогеназы CYS HIS NAD + Координационный катализ Ионные взаимодействия Кислотно-основной катализ

Способы регуляции: 1. Аллостерическая регуляция 2. Ковалентная модификация 3. Диссоциация неактивного предшественника (зимогена), на активный фермент

1. Аллостерическая регуляция эффектор Каталитическая субъединица с активным центром Неактивный фермент Регуляторная субъединица с аллостерическим центром Активный фермент S субстрат S ES-ферментсубстратный комплекс

2. Ковалентная модификация Неактивный Е СН 2 ОН Акт.Е СН 2 О-РО 3 Н 2 АТР АDP Н 3 РО 4 Фосфорилирование - дефосфорилированиеa) б) активация зимогенов - предшественников ферментов трипсиноген + Val-(Asp) 4 -Lys Энтеро- пептидаза Не активен трипсин активен

Регуляция действия ферментов E4E4 E3E3 E2E2 E1E1 A B C D P Ингибирование по принципу обратной связи Исходный субстрат Конечный продукт Мультиферментная система, осуществляющая превращение А в Р в ходе четырех последовательных ферментативных реакций

В каждой метаболической цепи есть фермент - «дирижер», который задает скорость всей цепочке реакций - р е г у л я т о р н ы й ф е р м е н т Регуляция действия ферментов

Каждый фермент имеет определенный оптимум рН Относи- тельная скорость Активность пепсина- фермента желудочного сока максимальна при рН~ Активность ферментов печени максимальна при рН ~ 7,2

Оптимальная температура Активность ферментов зависит от температуры Активность Активность Температура, 0 С Для большинства ферментов t опт = С При высоких температурах реализуется денатурация ферментов

Кинетика ферментативных реакций E - фермент S - субстрат P - продукт E + SESP + E Промежуточный фермент-субстратный комплекс k1k1 k2k2 k3k3

Кинетика ферментативных реакций a - начало реакции, [S] > [E], начальная скорость прямо пропорциональна [S] б - при [E] = const, cкорость реакции достигает Vmax, когда весь фермент включен в [ES] V 0 ~[E]

1. Скорость образования ES = k 1 [E] [S] 2. Скорость исчезновения ES = k 3 [ES] + k 2 [ ES] k 1 [E] [S] k 3 [ES] + k 2 [ ES] = 3. Общая концентрация фермента [Eобщ] = [ES] + [Eсв] 4. Принимая, что ES k3k3 P + E получим для начальной скорости V 0 = k 3 [ES]

5. Максимальная скорость процесса Vmax достигается при насыщении фермента субстратом, т.е. при [Eсв] = 0, тогда [ES]max = [Eобщ], и Vmax = k 3 [ES]max = k 3 [Eобщ] 6. Принимая, что [E] = [Eсв], получим: [ES] = k1k1 k 2 + k 3 [Eсв] [S]

Km = k 2 + k 3 k1k1 Константа Михаэлиса - Ментен 7. Подставив Кm в уравнение 6, получим: [ES] = [Eсв] [S] Km

8. Т.к. из ур.4: [ES] = V 0 /k 3, подставив это выражение в ур.7, получим: V0V0 k3k3 = [Eсв] [S] Km V 0 = k 3 [Eсв] [S] Km или 9. Т.к. из ур. 3 [Eсв] = [Eобщ] - [ES], тогда из ур. 8 получим: V 0 = k 3 [Eобщ] [S] - k 3 [ES] [S] Km

10. Поскольку k 3 [Eобщ] = Vmax и k 3 [ES] = V 0, V 0 = Vmax [S] - V 0 [S] Km 11. После преобразования ур.10 получим: V 0 = Vmax [S] Km + [S] Кинетическое уравнение Михаэлиса - Ментен

Анализ уравнения Михаэлиса -Ментен 3. Km = [S], тогда V 0 = 1/2 Vmax Vmax [S] Km + [S] V 0 = 1. [S] > Km, тогда V 0 ~ Vmax 2 3 3

График уравнения Михаэлиса - Ментен в обратных координатах - график Лайнуивера - Бэрка - Km 1 1/V 1/S 1 Vmax tg = Km / Vmax 1 / V 0 =1 / Vmax + Km / Vmax. 1 / [S]

Характеристики активности фермента 1. Молярная активность (число оборотов) - число молей субстрата, реагирующего с 1 моль фермента за единицу времени (мин или сек) СO 2 + H 2 O H 2 CO 3 E E - карбонат-дегидратаза Молярная активность = моль СO 2 /мин/моль Е 2. Km характеризует специфичность действия фермента,чем меньше Km, тем больше сродство фермента к субстрату

Ингибирование ферментов Необратимое ингибирование Обратимое ингибирование конкурентноенеконкурентное

ВРЕД! При необратимом ингибировании фермент надолго или навсегда теряет свою активность, что может привести к летальному исходу!!

Необратимое ингибирование путем ковалентной модификации Вред!! Фермент - ацетилхолин- эстераза Ингибитор - диизопропил- фторфосфат Неактивный фермент

Польза!! пенициллин Необратимое ингибирование путем ковалентной модификации

Обратимое ингибирование ферментов Конкурентное ингибирование Неконкурентное ингибирование EEI ES E + P I EES E + P ESIEIEI I I S S

Конкурентное ингибирование EIEIEESES E + P I S ФЕРМЕНТ субстрат ингибитор- конкурент

Конкурентные ингибиторы Конкурентными ингибиторами могут быть структурно родственные соединения

HOOC-CH 2 -CH 2 -COOH HOOC-C=C-COOH HOOC-COOH - щавелевая кислота HOOC-CO-CH 2 -COOH - оксалилуксусная кислота HOOC-CH 2 -COOH - малоновая кислота HOOC-(CH 2 ) 3 -COOH - глутаровая кислота Н Н FAD FADH 2 SUCFUM

Действие сульфамидных препаратов основано на конкурентном ингибировании Фолиевая кислота предшественники Тетра- гидро- фолиевая кислота п-аминобензойная кислота (ПБК) сульфаниламид Конкурентное ингибирование

Устранение ингибирования Конкурентное ингибирование может быть ослаблено или устранено повышением концентрации субстрата

Неконкурентное ингибирование ингибитор фермент центр связывания субстрата E ES E + P EI ESI II S S

Неконкурентное ингибирование Неконкурентное ингибирование происходит в результате присоединения ингибитора к аллостерическому центру, что меняет третичную структуру фермента, снижая его родство к субстрату

Зависимость 1/V от 1/S без ингибитора (1) и в присутствии ингибитора (2) 1/V 1/S 1/V 1/S а - конкурентное ингибирование б - неконкурентное ингибирование 1/Vmax -1/Km

Необратимое ингибирование (1) (2) 1/V 1/S (без ингибитора) (с ингибитором) 1/Km 1/Vmax

Ферменты в биотехнологии Ферменты широко используются в пищевой промышленности Ферменты находят применение более чем в 25 отраслях: сельском хозяйстве, медицине, промышленности:

Иммобилизация фермента - закрепление на полимерном носителе (полистироле) Иммобилизованный фермент не смешивается с продуктами реакции, более устойчив к денатурации

Рекомендуемая литература: 1. Ю. Б. Филиппович. Основы биохимии, 1999, с ; 2. В.П. Комов, В.Н. Шведова. Биохимия, 2004, с Ю. Б. Филиппович. Основы жизнедеятель- ности человека, 2004, гл Е. В. Румянцев, Е. В. Антина,Ю. В. Чистяков. Химические основы жизни, 2007, гл. 2.

Коферменты и витамины Рекомендуемая литература: 1. В.П. Комов, В.Н. Шведова. Биохимия, 2004, с , Ю. Б. Филиппович. Основы жизнедеятель- ности человека, 2004, с Е. В. Румянцев, Е. В. Антина,Ю. В. Чистяков. Химические основы жизни, 2007, гл. 3.