Электронная коллекция микроорганизмов с маркерными признаками, перспективных для мониторинга и биотестирования действующих природных и антропогенных факторов *Бояндин Анатолий Николаевич *Ланкин Юлий Петрович **Лобова Татьяна Ивановна **Каргатова Татьяна Васильевна *Могильная Ольга Алексеевна *Попова Людмила Юрьевна *Институт биофизики СО РАН, **ООО «Территориально-ориентированные информационные системы»

1. Устойчивость к антибиотикам 2. Устойчивость к тяжелым металлам 3. Устойчивость ко ксенобиотикам 4. Устойчивость к действию физико-химических факторов 5. Биолюминесценция 6. Флуоресценция 7. Способность к утилизации различных специфических органических субстратов (алканов, аренов, ПАУ и т.д.) 8. Не экспрессирующие гены, обнаружение которых возможно с помощью метода PCR 9. Специфические маркеры (16S or 23S РНК) PCR/Hyb РАСПРОСТРАНЕННЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ У БАКТЕРИЙ

Увеличение в экосистеме клеток микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам, тяжелым металлам, ксенобиотикам, может свидетельствовать об усилении влияния соответствующих факторов на экосистему. Соответственно, динамика проявления в микробных сообществах таких признаков, как устойчивость к факторам среды или способность к деградации поллютантов, как и появление в популяции большого числа клеток с соответствующими генетическими маркерами, может использоваться в мониторинге микробных сообществ для анализа действующих на экосистему природных и антропогенных факторов. ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ В МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВАХ

НА ПРИМЕРЕ ОЗЕР РАЗНОЙ СТЕПЕНИ МИНЕРАЛИЗАЦИИ Пресноводные (Баланкуль, Иткуль, Кротовая Ляга, Мылка); Слабосоленые (Шира, Утиное -1); Соленые (Михайловское, Шунет, Соленое, Ханкуль, Утиное - 2); Гиперсоленые (Тус) В большинстве озер (исключая пресноводные) доминируют средне и умеренно галотолерантные бактерии. Генетические маркеры устойчивости к антибиотикам, органическим поллютантам и тяжелым металлам были обнаружены в большинстве клеток аллохтонных бактерий (более изолятов), но у них не проявлялся фенотип устойчивости к высокой солености или низкой температуре. Это было особенно характерно для литеральной зоны озер с высокой антропогенной нагрузкой (Шира, Баланкуль, Иткуль, Кротовая Ляга, Мылка). В центральной зоне озер, особенно в гиполимнионе доминировали автохтонные бактерии, проявляющие способность к утилизации органических поллютантов, способных к росту при температурах 3-10 о С и устойчивые к изменению уровня минерализации в водной среде. Но автохтонные виды бактерий были чувствительны к антибиотикам разного типа действия. ПРИМЕРЫ ИЗУЧЕНИЯ РАСПРОСТРАНЕННОСТИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ У МИКРООРГАНИЗМОВ

ПЛАЗМИДЫ могут быть генетическими маркерами существенного влияния на микробное звено и на экосистему в целом действия естественных или антропогенных факторов. Увеличение в бактериальной популяции одного вида числа клеток, несущих плазмидные ДНК устойчивости или деградации определенных классов поллютантов, может служить сигналом усиления влияния данного фактора в экосистему. Например, в бактериях разных видов в озере Шира обнаружены плазмиды, у которых в ряде случаев установлена функциональная значимость кодируемых ими генов: pSH1 – 2,7 тпн – определяет устойчивость к повышенным концентрациям минеральных солей; pSH2- около 20 тпн – определяет устойчивость к ионам меди в концентрациях выше 250 мг/л; pSH3 – около 50 тпн – предположительно, кодирует гены деградации полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) (клетки - хозяева данной плазмиды разлагают нафталин в присутствии глюкозы). Кроме того, выделены плазмиды, размером от 4,4 до 11,5 тпн, а также плазмиды более 20 тпн, но менее 30 тпн, предположительно ответственные за устойчивость к антибиотикам или за деградацию поллютантов типа ПАУ или нефтепродуктов. Необходимо отметить, что предложенный метод с большой точностью выявляет хромосомные маркеры, однако в ряде случаев, особенно гены устойчивости к антибиотикам могут кодироваться интегронами, например транспозонами, в которых отсутствуют регуляторные участки связывания с белками репрессорами. ПЛАЗМИДЫ (ВНЕХРОМОСОМНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ) КОДИРУЮТ МНОГИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ

Клонированные или природные маркерные гены должны обеспечивать мониторинг клеток не только в модельных, но и в природных экосистемах Трансгенные или природные микроорганизмы Трансгенные или природные микроорганизмы с маркерными генетическими системами Экосистемы Микроэкосистемы Хромосомная или плазмидная ДНК с маркерным геном

БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ - УНИКАЛЬНОЕ ПРИРОДНОЕ ЯВЛЕНИЕ - характерна для живых организмов различных систематических групп; - чувствительна к воздействию множества факторов; - можно клонировать lux-гены в других организмах (в том числе, конструируя штаммы с избирательной чувствительностью) Основные области применения: - изучение воздействия различных факторов на клетки; - анализ экспрессии генов; - исследования изменений в популяциях микроорганизмов; - биотест на различные химические соединения В НАСТОЯЩЕЕ ВРЕМЯ ДЛЯ ЭТИХ ЦЕЛЕЙ ШИРОКО ИСПОЛЬЗУЮТСЯ КЛОНИРОВАННЫЕ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ ОПЕРОНЫ ИЗ МОРСКИХ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ (LUX-ОПЕРОНЫ)

FMNH 2 + O 2 + CH 3 (CH 2 ) n C H O CH 3 (CH 2 ) n C H O FMN + H 2 O + + СВЕТ NAD(P)H FADH 2 FMNH 2 Метаболизм жирных кислот O2O2 Дыхательная цепь ATP Биосинтез PO CDE Организация lux-оперона Глюкоза cAMP Обозначения Гены биосинтеза альдегидного фактора БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ И ЕЕ ВЗАИМОСВЯЗЬ С ОБЩИМ МЕТАБОЛИЗМОМ Схема реакции Гены, кодирующие люциферазу Регуляторные участки

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ LUX-ОПЕРОНОВ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КЛОНИРОВАННЫХ LUX-ГЕНОВ МИКРОБНАЯ ЭКОЛОГИЯ - мониторинг трансгенных микроорганизмов (ТМ) - изучение механизмов адаптации ТМ к факторам окружающей среды - оценка влияния интродукции TM на микробное разнообразие - тестирование наличия и концентраций поллютантов МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭКОЛОГИЯ - мониторинг клонированных вставок ДНК - изучение механизмов миграции гетерологичных вставок ДНК в окружающей среде

1) Экспрессивность анализа 2) Хорошо изучена структурная и молекулярная организация lux-оперонов, а также механизмы люциферазной реакции в светящихся организмах 3) lux-гены могут быть использованы как репортерные в прогнозе поведения ТМ после случайной или целенаправленной интродукции в окружающую среду 4) Возможность контроля экспрессии биолюминесценции факторами окружающей среды при клонировании lux-оперонов под специфичными промоторами (расширение границ биотестирования) 5) Возможность изучения механизмов регуляции при использовании различных промоторов, контролирующих экспрессию lux-генов 6) Возможность клонирования только генов двух субъединиц люциферазы (AB). Это позволяет снизить нагрузку на метаболизм клетки-хозяина и индуцировать биолюминесцентный сигнал добавлением экзогенного альдегида – субстрата люциферазы. НО: НЕОБХОДИМЫ ОБОБЩЕНИЕ И СИСТЕМАТИЗАЦИЯ СУЩЕСТВУЮЩЕЙ ИНФОРМАЦИИ ПО ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫМ СВЕТЯЩИМСЯ МИКРООРГАНИЗМАМ! ПРЕИМУЩЕСТВА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БАКТЕРИЙ С КЛОНИРОВАННЫМИ LUX-ГЕНАМИ ДЛЯ АНАЛИЗА

ЗАДАЧИ ПРИ СОЗДАНИИ ИНФОРМАЦИОННОЙ СИСТЕМЫ 1) определение перечня объектов, информация о которых должна храниться в ИС, их характеристик и логических отношений между ними; 2) построение логической модели ИС, включающей структуру таблиц, типы содержащихся в них полей и межтабличных связей; 3) физическая реализация табличной структуры и разработка программного обеспечения серверной части ИС; 4) разработка клиентской части, позволяющей администраторам ИС осуществлять ручной и автоматизированный ввод данных; 5) создание Web-интерфейса, дающего доступ к информации через Интернет, включая возможность составления запросов; 6) анализ имеющейся в мире литературы по проблематике создаваемой ИС и ввод соответствующей информации в ИС; 7) организация работы по сбору информации, включая разработку опросных форм для последующего добавления информации в ИС.

СИСТЕМА УПРАВЛЕНИЯ БАЗОЙ ДАННЫХ Характеристики СУБД - Платформа Microsoft Windows 9x/NT - Сервер Sybase Adaptive Server Anywhere Среда проектирования Computer Associates ERwin Система программирования Borland C++ Builder Интерфейс доступа к данным ODBC Borland Database Engine (BDE)

ОСНОВНАЯ ФОРМА ОПИСАНИЯ СВОЙСТВ ШТАММОВ

ОПИСАНИЕ СВОЙСТВ СВЕТЯЩИХСЯ МИКРООРГАНИЗМОВ И LUX-ОПЕРОНОВ

gene="luxA" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="luciferase alpha subunit" /protein_id="CAA " 1 tcgagcagcc attggcttag acagtgaagt gattgattta gttgatgata ttagtgagcc

ПРИМЕРЫ ВОЗМОЖНОСТЕЙ СУБД Контроль случайного удаления записей Поиск информации

Заключение: Исследование резистентности доминирующих популяций водных экосистем к различным факторам на селективных средах позволяет определить ключевые действующие на экосистему факторы. Анализ плазмидного профиля и проявления определенных генетических маркеров в доминирующих популяциях бактерий позволяет определить природные и антропогенные факторы, оказывающие наиболее существенное влияние на микробное сообщество. Разработанная база данных по клонированным lux-генам позволяет решать задачи по сбору и анализу данных по светящимся трансгенным микроорганизмам и расширению возможностей использования биолюминесцентных маркерных систем. Разработанный подход систематизации данных по микроорганизмам, несущих маркерные клонированные lux-гены в различных векторах (хромосомы, плазмиды, транспозоны, фаги, вирусы), может облегчить создание базы данных для природных бактерий, несущих маркерные генетические системы, соответственно в хромосомах, плазмидах и интегронах. В свою очередь, создание базы данных по природным микроорганизмам конкретных экосистем, может позволить проводить более целенаправленный анализ состояния каждой экосистемы в сравнении с другими экосистемами с разным уровнем антропогенной нагрузки.