1. Феномен ЦМС и восстановления фертильнаости пыльцы 2. Связь ЦМС с митохондриями 3. Химерные гены в митохондриях и происхождение ЦМС 4. Экспрессия ЦМС – генов 5. Механизм действия ядерных генов-восстановителей фертильнаости 6. Ядерно-плазменный конфликт при ЦМС у пшеницы 7. Природа дефектов, возникающих при ЦМС Лекция 10. ЦМС растений – самая доходная митохондриальная мутация

Мужская стерильность растений (МС) стерильность пыльцы генетически контролируемое нарушение развития пыльцы у растений ГМСЦМС Генная (гены ядра) Цитоплазматическая (гены органелл)

ЦМС описана более чем у 150 видов высших растений По некоторым данным, ЦМС найдена более чем у 300 видов высших растений 47 родов 20 семейств ЦМС широко используется в семеноводстве для получения гибридных семян – это самая «доходная» цитоплазматическая мутация, ежегодно приносящая многомиллионные прибыли

Как возникают растения с ЦМС? 1. Спонтанно - обнаруживаются обычно при анализе больших популяций различных с/х культур. Нередко ЦМС-формы обнаруживаются у диких родичей культивируемых с/х растений 2. Наиболее часто формируются ЦМС-растения так называемой «гибридной природы». Цитоплазматической стерильность пыльцы возникает как результат ядерно-плазменной несовместимости при некоторых отдаленных скрещиваниях. Классические примеры стерильности второго типа : - алло плазматические пшеницы Triticum aestivum на цитоплазме Aegilops ovata или Triticum timopheevi, - линии подсолнечника Helianthus annuus на цитоплазме Helianthus petiolaris, - серия стерильных линий табака Nicotiana tabacum на цитоплазме N. repanda, - ЦМС-формы у различных видов рода Brassica.

Как возникают растения с ЦМС? (продолжение) 3. ЦМС может возникнуть и в результате некоторых внутривидовых скрещиваний а также при соматической гибридизации 4. У самоопыляющихся растений (бобовые), ЦМС-мутация сохраняется у множества диких форм в субстохиометрических количествах, а при определенных ядерно-плазменных комбинациях количество ее копий в митохондриях может возрасти в раз и проявиться фенотипически. 5. Искусственное получение новых мужски стерильных форм производится также с использованием сомаклональной изменчивости, характерной для культур in vitro. Так были отобраны ЦМС-формы табака, риса, кукурузы, сорго.

В случае доминантных Rf генов фертильнаость восстанавливается уже в гибридах F1: rfrf(Sцит) x RfRf(Nцит) Rfrf (Sцит) В природных популяциях растений разных видов выявлены и продолжают выявляться ядерные гены Rf (restoration of fertility), восстанавливающие полностью или частично фертильнаость пыльцы Гены-восстановители фертильнаости В некоторых случаях ЦМС восстанавливается с помощью не одного, а нескольких Rf генов смс ферт ферт

Почему причину ЦМС искали в митохондриях? Признак передавался по материнской линии Признак представлялся связанным с нарушением энергетических процессов в пыльниках (митохондрии???) Уже ранние цитохимические и электронно-микроскопические исследования, посвященные ЦМС, свидетельствовали о серьезных нарушениях в митохондриях стерильных растений Предположения о мутации в митохондриальной ДНК были сделаны на основе этих данных (60-е 70-е гг.)

В следующее десятилетие ( ) были получены первые данные об отличии митохондриальных ДНК стерильных растений кукурузы от нормальных Было показано, что каждый тип стерильности – T, C и S - характеризовался своим уникальным спектром фрагментов мтДНК при эндонуклеазой рестрикции

Химерные гены в митохондриях и происхождение ЦМС При исследовании митохондриальной ДНК кукурузы с Т-типом ЦМС с помощью геномной библиотеки была обнаружена область, экспрессирующаяся во всех тканях стерильных растений иначе, чем у нормальных Так был впервые локализован ЦМС-ген T-urf13 и его продукт – белок 13 кД

30 н atp6 444 н 291 кодон 56 н 318 н 26S рРНК T-atp6 N-rrn26 T-ЦМС urf25 urf кодон N-urf25 urf кодонов табак тРНК arg ? К образованию такого химерного гена привели не менее 7 рекомбинаций Химерный ген в митохондриях стерильных растений кукурузы Т-типа (техасского) 5-фланкирующая последовательность перед геном T-urf13 гомологична 5- фланкирующей области atp6 гена – вероятно, промотор гена T-urf13 появился в результате дупликации участка мтДНК – промотора гена atp6 и дальнейшей рекомбинации последовательность неизвестного происхождения

У митохондрий кукурузы S-типа также были обнаружены мтДНК реорганизации, результатом которых явились два химерных гена У кукурузы выявлено 3 различных типа ЦМС, при всех этих типах обнаруживаются разные химерные гены Химерный ген мтДНК при С-типе стерильности составлен из «кусков» митохондриальных и пластидных ДНК atp6- -atp9 141 кодонcoxII- orf355orf77

Структура R -области мтДНК при ЦМС S-типа R повтор (1060 пн) – сходство с R1 плазмидой Сходство с ntp9 геном ??? последовательности Сходство с atp9 геном

У Petunia c ЦМС связан участок мтДНК, называемый S-pcf локус состоит из трех котранскрибируемых генов: pcf, nad3 и rps12 Хп atpB фертильнаый nad3 rps12 S-atp9 S-pcf сox2-1 Urf S ЦМС-локус S-pcf у петунии Последовательности обоих экзонов coxII присутствуют без интронов

Структура pvs – локуса у фасоли с ЦМС orf98 orf239 Гомология с Гомология с Гомология с 3-концом cox2 хлоропластным 3-концом cob гена тРНК Аla интроном pvs Область размером 3 kb содержит несколько открытых рамок считывания, образованных при рекомбинациях мтДНК

Стрелки указывают направление транскрипции Структура ЦМС-локуса у подсолнечника atpA orf873 cob Ферт Стер Инсерция инверсия 5 тпн 11 тпн atpA orf522 orf873 cob Не выявлено транскриптов

Как осуществляется транскрипция при ЦМС? Химерные гены часто котранскрибируются вместе с нормальными orf 522 с atpA (Helianthus) pcf с nad3 и rps12 (Petunia) orf224 с atp6 (pol-Brassica) orf222 с участком гена nad5 и orf139 (nap-Brassica) orf105 c atp6 (редис)

Например, промотор гена atp6 инициирует транскрипцию urf13 кукурузы и химерной orf риса с ЦМС-Bo В других случаях у химерных генов оказались собственные сайты инициации транскрипции переместились из других orf в результате реорганизаций мтДНК Транскрипция ЦМС-локусов происходит по общим законам, с промоторов, уже существовавших в митохондриальных геномах

РНК-эдитинг и ЦМС T-urf13 является единственным известным в настоящее время у высших растений белок-кодирующим митохондриальным геном, не подвергающимся РНК-эдитингу В химерных генах, состоящих из фрагментов разных генов, эдитинг происходит в позициях, точно соответствующих точкам редактирования полных транскриптов этих генов

Феномен явно зависит от ядерного генома: у одних линий с такой же цитоплазмой atp6 пыльников нормально редактировались, у других - нет Феномен транскрипт-специфической утраты РНК-эдитинга Описан только у сорго В митохондриях пыльников линии Sorghum bicolor A3Tx398 (ЦМС) было избирательно подавлено редактирование транскрипта atp6 При этом транскрипты atp9, nad3, nad4, rps12 нормально редактировались как в пыльниках, так и в этиолированных проростках Подавление atp6 РНК- эдитинга наблюдалось как в спорофитных, так и в гаметофитных тканях пыльника, но ни в каких других

Трансляция ЦМС-генов Размер продукта гена urf13 соответствовал уже известному белку 13 кД Белок 13 кД Синтез in vitro Изолированные митохондрии ЦМС фертильна - Идентифицирован еще до описания гена urf13.

Антитела к полипептидам реагировали с 13 кД белком в ЦМС линиях На основе первичной последовательности гена urf13 были синтезированы полипептиды синтезировался изолированными митохондриями ЦМС-линий Аналогичным образом был найден ЦМС-белок у Petunia полипептид 25 кД отсутствовал у фертильнаых аналогов

ЦМС-белки кукурузы, петунии, подсолнечника выявляются во всех органах стерильных растений Белок фасоли pvs-ORF239 оказался специфичным только для репродуктивных тканей: семяпочек, материнских клеток пыльцы и микроспор мужски стерильных растений Модуляция экспрессии гена orf239 – первый известный случай посттранскрипционной регуляции в митохондриях растений

Вегетативные ткани мРНК orf239 ORF239 Репродуктивные ткани ORF239 Митохондриальная протеаза ORF239 Модуляция экспрессии гена orf239 фасоли

иммуноцитохимический анализ обнаруживал белок ORF239 в клеточной стенке аномальных микроспор Ген orf239 фасоли вызывает стерильность при встраивании в ядерный геном табака несколько трансформантов характеризовались мужски- стерильным или полустерильным фенотипом

Ядерные гены – восстановители фертильнаости: механизм действия Нарушение развития пыльцы у растений с мутантной цитоплазмой также может быть откорректировано специальными ядерными генами Rf – восстановителями фертильнаости Эта коррекция происходит на разных этапах – от репликации ДНК до взаимодействия с ЦМС-белками

1. Эффект генов Rf на митохондриальный геном Ген-восстановитель фасоли Fr приводит к изменению структуры митохондриальной ДНК: из генома митохондрий исчезает pvs последовательность Одна доза гена (Frfr) инициирует процесс элиминации pvs – локуса и проявляется в полустерильном фенотипе: продуцируется как стерильная, так и фертильнаая пыльца Для полного исчезновения pvs – локуса и полного восстановления фертильнаости ген Fr должен быть в гомозиготном состоянии (FrFr) Вероятно, продукт гена Fr избирательно элиминирует те митохондрии, которые содержат pvs–локус

Органеллы, содержащие pvs-локус, у фертильнаых ревертантов сохраняются в субстохиометрическом количестве – менее одной копии на 100 клеток Но откуда у ЦМС растений нормальные митохондрии? Скорее всего, в незначительном количестве они сохраняются даже при ЦМС

Ген Rf3 кукурузы S1 S2 S2 мтДНК S1 и S2- репликоны в митохондриях исчезают как самостоятельные ДНК- молекулы но в митохондриальном геноме обнаруживаются S -последовательности Модифицирует структуру митохондриального генома ген- восстановитель Rf3 S-типа стерильности кукурузы

2. Эффект генов Rf на экспрессию ЦМС-локусов urf13 пре-мРНК urf13 мРНК urf13 основным у растений с Rf1-аллелем становится «укороченный» транскрипт, содержащий неполную последовательность urf13 количество 13 кД «стерильного» белка снижено Rf1 Присутствие гена Rf1 незначительно подавляет транскрипцию мРНК urf13, но изменяет процессинг мРНК urf13 Уменьшено число полных матриц Т-тип ЦМС кукурузы Растения кукурузы с Т-типом цитоплазмы и геном Rf1 в ядре, несмотря на уменьшение количества 13 кД белка, остаются мужски стерильными

Лишь в присутствии доминантного аллеля второго гена- восстановителя – Rf2 восстанавливается нормальный процесс формирования жизнеспособной пыльцы. Каков механизм действия гена Rf2, неизвестно. Ген Rf2 кодирует белок, чрезвычайно сходный с митохондриальной альдегид дегидрогеназой Для восстановления фертильнаости при Т-типе цитоплазмы необходимо два гена: Rf1 и Rf2

Rf3 у кукурузы с ЦМС-S также приводит к появлению более коротких транскриптов митохондриальных генов cob, atp6, orf355, orf77 в пыльце восстановленных растений по сравнению со стерильной пыльцой У петунии под действием генов-восстановителей также происходит снижение уровня 25 кД белка, кодируемого S-pcf локусом

Восстановление фертильнаости у подсолнечника Связано с тканеспецифическим уменьшением количества молекул транскриптов химерного цистрона atpA-orf522 происходит только в мужских цветках восстановленных растений Механизм действия гена – восстановителя в данном случае – полиаденилирование РНК- матриц, что вызывает их ускоренную деградацию

Ген изменяет полученный orf224/atp6 транскрипт: Ген-восстановитель Brassica действует тканеспецифически У стерильных линий обнаруживаются два полноразмерных транскрипта размером 2.2 и 1.9 т.п.н У восстановленных линий появляются более короткие, прошедшие процессинг транскрипты 1.4 и 1.3 т.п.н такие транскрипты обнаруживаются в лепестках, тычинках, плодолистиках, но не в чашелистиках

Итак, на стадии транскрипции основные механизмы действия Rf-генов: – укорочение транскриптов (процессинг); - уменьшение числа матриц мРНК (полиаденилирование с ускоренным распадом).

Транскрипция и трансляция гена orf138 как стерильных, так и восстановленных растений осуществляются с равной эффективностью 3. Эффект генов Rf на посттрансляционную регуляцию В присутствии генов Rf отмечается снижение количества белка ORF138 у рапса с типом ЦМС ogura Эффект сильнее всего выражен в пыльниках на той стадии, на которой обычно экспрессируется стерильный фенотип Rfо ген рапса действует на посттрансляционном уровне, уменьшая стабильность белка ORF138 и восстанавливая фертильнаость

Эффект генов Rf на РНК-редактирование от аtp6 гена отщепляется аномальный 3' участок (причина ЦМС), после чего проходит нормальный эдитинг Rf3 ген у риса действует на процессинг дицистрона: Rf3 ген у сорго облегчает процессинг прошедших эдитинг транскриптов на 75% уменьшается количество длинных транскриптов гена orf107 (1110, 870 пн), накапливаются короткие 380 пн, которые у стерильных форм были в следовых количествах

У петунии удалось выделить и клонировать ген, который прямо влияет на экспрессию CMS-гена ( (

если ЦМС возникает в результате синтеза новым химерным геном какого- то токсического продукта, ген-восстановитель должен каким-то образом инактивировать этот ген либо его продукт Эффект ядерных генов- восстановителей фертильнаости может быть двух типов: если ЦМС возникает в результате потери или инактивации какого-то фактора, то ген- восстановитель должен обеспечить растение комплементарно действующим субстратом Большинство исследованных к настоящему времени ЦМС-систем и генов-восстановителей представляют пример второго типа

Системы восстановления фертильнаости, вероятно, не менее разнообразны, чем ЦМС-системы Восстановители фертильнаости разных ЦМС-систем могут: - снижать количество полноразмерных транскриптов ЦМС-генов, влияя на РНК-процессинг и РНК- эдитинг; - изменять число копий митохондриальных хромосом, несущих ЦМС-ген - уменьшать количество продукта ЦМС-генов, действуя посттрансляционно

Природа дефектов, возникающих при ЦМС Первые признаки аномального развития пыльников часто, хотя и не всегда, наблюдаются на стадии мейоза материнских клеток пыльцы Прямые доказательства критической роли тапетума в развитии пыльцы были получены на трансгенных растениях: тапетум Чужеродный рибонуклеазный ген, экспрессирующий токсический продукт под действием специфического для ткани тапетума промотора, вызывал формирование стерильных пыльников В клетках тапетума количество митохондрий увеличено в раз по сравнению с другими тканями растений ???

Трансформанты, получившие orf239, имели стерильную или полу-стерильную пыльцу Действительно ли orf239-ген фасоли виновен в формировании стерильности пыльцы??? orf239 Ген был введен в ядерный геном табака При этом их митохондрии не несли никаких мутаций!

к токсину, вырабатываемому грибом Helminthosporium maydis Растения с Т-типом ЦМС у кукурузы высокочувствительны к пестициду метомилу Ген urf13 ЦМС-T кукурузы была введен в экспрессируемом векторе в E. сoli Трансформированные бактериальные штаммы отличались морфологическими изменениями и/или замедленным ростом и, так же, как ЦМС-T растения, были чувствительны к грибному токсину Если ген urf13 изменялся в результате мутации, все перечисленные эффекты исчезали

Токсин H. maydis связывается с белком URF13 в митохондриях это приводит к увеличению проницаемости мембран митохондрий и нарушению дыхания

В отсутствие токсина растения с Т-цитоплазмой абсолютно не проявляют фенотипической депрессии, лишь развитие пыльцы останавливается пыльники продуцируют какое-то вещество, которое действует аналогично Т-токсину или метомилу, что и приводит к их аномалии Гипотеза: Природа данного вещества и сам факт его существования пока не установлены

ЦМС – еще одна загадка эволюционного процесса В ядерном геноме некоторых образцов присутствуют гены, подавляющие весьма тонким образом экспрессию строго определенного локуса чужого митохондриального генома, с которым эти образцы никогда возможно ранее не контактировали эти гены оказываются эффективными уже при первой встрече со стерильной цитоплазмой У некоторых видов растений ЦМС- гены митохондрий имеют гомологичные нуклеотидные последовательности – горизонтальный перенос???

Разгадывайте загадки природы