1 Зиновкина Людмила Андреевна, к.б.н., ст. преп. ФББ МГУ, Лекция 1. Митохондриальный протезом, структура мтДНК, генетика митохондрий. Репликация мтДНК. Лекция 2. Репликация мтДНК. Метилирование мтДНК. Лекция 3. Репарация мтДНК. Лекция 4. Транскрипция мтДНК. Лекция 5. Процессинг мтРНК.

2 Лекция 1: Митохондриальный протезом Структура мтДНК Генетика митохондрий Репликация мтДНК

3

4 Часть белков эндосимбионта до сих пор функционируют в митохондриях (ферменты окислительного фосфорилирования, компоненты рибосом) Часть белков потеряна в ходе эволюции. Добавились новые белки (белки системы митохондриального импорта) Митохондрии произошли от α-протеобактерий: PMID:

5 Потеря белков митохондрией в ходе эволюции в основном происходила на ранних этапах: Из 370 белков бактериального предка 161 не найдены в митохондриях Млекопитающих. Из 161 потерянного белка 115 (71%) ни найдены ни в одном организме => потеря произошла еще до дивергенции эукариот. LECA – last eukariotic common ancestor Opisthokonts – общий предок грибов и многоклеточных животных PMID:

6 Потеря белков митохондрией: Часть белков потеряна полностью в связи с потерей функции (ферменты ответственные за синтез компонентов клеточной стенки) Часть белков локализованы и функционируют в других клеточных компартиментах, поскольку их гены перенесены в ядро => их продукты могут выполнять свои функции не в митохондриях (ферменты биосинтеза гема частично работают в митохондрии, другая часть ферментов участвует в биосинтезе жирных кислот вне митохондрии)

7 Потерянные бактериальные белки часто заменялись другими неортологичными белками Например, DNA polymerase γ, POLRMT и TWINKLE имеют высокую гомологию с ферментами Т3/Т7 фагов. PMID:

8 Перенос происходит из-за высокой частоты мутаций в связи с близостью дыхательной цепи. Ортологичные гены у разных видов организмов могут находиться в разных геномах – митохондриальном или ядерном. Перенос бактериальных генов из митохондриального генома в ядерный

9 Все белки, необходимые для репликации, транскрипции и трансляции мтДНК расположены в ядерном геноме.

10 Для репликации и экспрессии мт генома, в котором сохранились всего несколько генов, необходима сложная ферментативная система. Почему в мтДНК вообще остались какие-то гены? Почему не все гены перенеслись в ядро? Гидрофобным белкам трудно транспортироваться в митохондрии от места их синтеза Действительно в мт ДНК остались гены двух самых гидрофобных из всех митохондриальных белков – субъединицы 1 цитохром с оксидазы и цитохрома b

11 Почему в мтДНК вообще остались какие-то гены? Почему не все гены перенеслись в ядро? Из-за разницы в генетическом коде трудно переместить некоторые гены в ядро Регуляция экспрессии генов митохондрий важна для контроля обмена веществ. На эту экспрессию могут непосредственно влиять компоненты дыхательной цепи, а также электрохимический потенциал.

12 В ходе эволюции происходило увеличение числа субъединиц в больших мульти ферментных митохондриальных комплексах Это может компенсировать мутации в старых субъединицах В единственном комплексе, гены всех компонентов которого локализованы в ядре – комплексе II - не менялось число субъединиц Новые субъединицы участвуют в регуляции работы комплексов Почему новые субъединицы добавлялись в комплексы? PMID:

13 1. Митохондрии произошли от α-протеобактерий 2. Часть белков эндосимбионта до сих пор функционирует в митохондриях Большая часть предковых генов перенесена в ядерный геном В геноме митохондрий человека осталось закодировано 13 белков 3. Часть белков эндосимбионта потеряна в ходе эволюции Потеря белков митохондрией в основном происходила на ранних этапах эволюции Некоторые утраченные белки заменены неортологичными 4. В митохондриальный протезом в ходе эволюции добавились новые белки В связи с возникновением новых функций у митохондрий по сравнению с бактериальным предком В ходе эволюции происходило увеличение числа субъединиц в больших мульти ферментных митохондриальных комплексах

14 МтДНК организована в ДНК-белковые комплексы – нуклеоиды. Нуклеоид содержит 1-10 копий мтДНК и белки, участвующие в репликации и транскрипции ДНК. Соматические клетки Млекопитающих содержат молекул мтДНК. The influence of ATP-dependent proteases on a variety of nucleoid-associated processes Journal of Structural Biology Volume 179, Issue 2, August 2012, Pages 181–192 Luboš Ambroa, Vladimír Pevalaa, Jacob Bauera, Eva Kutejová

15 TFAM (mitochondrial transcription factor A) участвует в пространственной организации нуклеоида: Имеет гомологию с ДНК-связывающими белками HMG (high mobility group), которые участвуют в пространственной организации ядерного хроматина. PMID:

16 TFAM (mitochondrial transcription factor A) участвует в пространственной организации нуклеоида. PMID:

17 Open circle Supercoiled circle Эти две формы составляют большинство у многоклеточных животных Head-to-tail circular dimer В клетках Млекопитающих показано наличие мтДНК в нескольких формах: PMID:

18 Catenane Их количество значительно варьирует: 10% у мыши, более 30% в клетках человека линии НЕК. У мыши не обнаружено катенанов из более чем 4 х молекул ДНК. В человеческих клеточных линиях встречаются катенаны из 8 ми молекул ДНК. У человека количество катенанов коррелирует с числом копий мтДНК. PMID:

19 Также организована мтДНК у некоторых растений, малярийного плазмодия и некоторых грибов: линейные геномы, соединенные Head-to-tail формируют многомерную сеть, в которой постоянно происходит репликация и рекомбинация. Структуры, образованные при рекомбинации найдены также в мозге человека и мыши, но не обнаружены в других тканях. МтДНК из сердца крысы, мыши, кролика, а также человеческих младенцев не образует сети, а имеет нормальную кольцевую двухцепочечную структуру. мтДНК в сердечной мышце взрослого человека организована в многомерную сеть, содержащий множество геномов. PMID:

20 1. МтДНК Млекопитающих организована в ДНК-белковые комплексы – нуклеоиды В одной клетке около 1000 нуклеоидов TFAM (mitochondrial transcription factor A) участвует в пространственной организации мтДНК в нуклеоидах 2. В клетках Млекопитающих мтДНК имеет разные формы: Open circle Supercoiled circle Head-to-tail circular dimer Catenane, в тканях человека их количество коррелирует с числом копий мтДНК мтДНК в сердечной мышце взрослого человека организована в многомерную сеть, содержащий множество линейных геномов.

21 Генетический код в мтДНК несколько отличается от универсального Универсальный генетический код Митохондриальный генетический код Дополнительный Met: Met способен восстанавливаться после окисления метионинсульфоксидредуктазой.

22 Некоторые кодоны редки или отсутствуют в мтДНК: Из 111 геномов: в не менее чем 76 нет одного или более кодонов (в среднем отсутствует 1.6 кодонов) В 101 хотя бы 1 кодон встречается менее трех раз (в среднем 4.3 кодона)

23 Мт ДНК кольцевая двухцепочечная молекула. Её цепи называются L (light) и H (heavy) из-за разницы в плавучей плотности в градиенте хлористого цезия. Н-цепь богата G, в L-цепи G значительно меньше PMID:

24 Митохондриальный геном человека содержит 37 генов: На L-цепи – 8 тРНК + 1 мРНК На Н-цепи – 2 рРНК + 14 тРНК +12 мРНК. Гены мтДНК у животных не содержат интронов. PMID:

25 1. Мт ДНК кольцевая двухцепочечная молекула. Её цепи сильно отличаются по нуклеотидному составу и называются L (light) и H (heavy) Генетический код в мтДНК отличается от универсального Некоторые кодоны редки или отсутствуют в отдельных мтДНК 2. Митохондриальный геном человека содержит 37 генов: 2 рРНК 22 тРНК 13 мРНК.

26 Генетика митохондрий МтДНК подвержена мутациям. Гомоплазмия – ни в одной молекуле мтДНК нет мутаций ИЛИ во всех молекулах мтДНК присутствует мутация Гетероплазмия – мутация присутствует в НЕКОТОРЫХ молекулах мтДНК.

27 МтДНК реплицируется в течение всего клеточного цикла, независимо от репликации в ядре, поэтому мутации в мтДНК при гетероплазмии накапливаются. При делении клетки с гетероплазмией возникает мозаичное распределение ДНК с мутацией.

28 Пациенты с гетероплазмией часто имеют разный уровень содержания мутантной ДНК в разных органах и даже в клетках одного органа. Дисфункция возникает при превышении определенного порога содержания мутантной мтДНК. Этот порог различен при разных заболеваниях. В среднем заболевание проявляется, когда: 50-60% мтДНК несет делецию Более 90% тРНК несет мутацию

29 При гомоплазмии все потомки больной матери будут также больными. 90% наследственной оптической нейропатии Лебера Мт ДНК передается только по материнской линии, т.к. мтДНК попадает в зиготу только из яйцеклетки, а мтДНК спермия деградирует в цитоплазме ооцита.

30 Мать с гетероплазмией может передать потомству разный уровень мутантной мтДНК, а может вообще не передать мутацию. 10% нейропатий Лебера: вероятность передачи заболевания потомству неизвестна

31 1. МтДНК в клетке может присутствовать в двух состояниях: гомоплазмия и гетероплазмия. 2. Мутации в мтДНК при гетероплазмии накапливаются. 3. При делении клетки с гетероплазмией возникает мозаичное распределение ДНК. 4. Пациенты с гетероплазмией часто имеют разный уровень содержания мутантной ДНК в разных клетках. 5. Мт ДНК передается только по материнской линии. 6. При гомоплазмии все потомки больной матери будут также больными. 7. Мать с гетероплазмией может передать потомству разный уровень мутантной мтДНК, а может вообще не передать мутацию.

32 Репликация мтДНК DNA pol γ Mt SSB – single strand DNA binding protein Mt DNA helicase TWINKLE Topoisomerases RNase H1 PMID:

33 Регуляторные участки в мтДНК NCR CSB TAS

34 В мт ДНК есть единственный некодирующий участок NCR (non-coding region), расположенный между генами tRNA Pro и tRNA Phe. CSB TAS В некоторых молекулах мтДНК присутствует оцДНК (650 нт), которая гибридизуется с материнской L- цепью в районе NCR, при этом формируется три цепочечная структура, которая называется D-loop (displacement loop). Считается, что D-loop образован репликацией, инициированной в ОН и терминированной в TAS. D-loop PhePro CSB TAS Ori H LSP HSP1 Ori b NCR CSB TAS PMID:

35 NCR содержит: Ориджин репликации O H и дополнительные ориджины (ori b) Участки регуляции репликации CSB (conserved sequence blocks) Участок терминации репликации TAS (termination- associated sequence). Предположительно один из белков MTERF может связываться с TAS. Промоторы для обеих цепей LSP и HSP1 Ori b

36 Хеликаза TWINKLE не обладает праймазной активностью => РНК- полимераза POLRMТ синтезирует РНК-праймеры для ДНК- полимеразы γ. POLRMT связывается с LSP, чтобы синтезировать полноразмерный транскрипт. Он разрезается или терминируется с образованием РНК-праймера длиной нуклеотидов PMID: Инициация репликации

37 Это напоминает механизм терминации транскрипции бактериофага Т7: РНК образует тРНК- подобную структуру, полимераза имеет низкое сродство к дцНК. Терминация транскрипции при синтезе праймеров для транскрипции POLRMT происходит за счет образования G-квадруплекса на РНК PMID:

38 Структура G-квадруплекса

39 на ORI L: POLRMT синтезирует праймер длиной около 25 нуклеотидов PMID:

40 В удалении РНК-затравок участвует РНКаза Н1. Возможно также участие хеликазы DNA2 и эндонуклеазы FEN1: если Pol γ встречает на своем пути РНК-затравку, не удаленную РНКазой Н, формируется flap-структура, содержащая РНК. РНК затем удаляется хеликазой DNA2 и Flap-эндонуклеазой FEN1. Затем лигаза сшивает разрыв в цепи.

41 1. РНК-праймеры для ДНК-полимеразы γ синтезирует РНК-полимераза POLRMТ. 2. РНК-праймеры удаляются РНКазой Н1 или, возможно, с участием хеликазы DNA2 и эндонуклеазы FEN1.

42 DNA pol γ Mt SSB – single strand DNA binding protein Mt DNA helicase TWINKLE Topoisomerases RNase H1

43 Модели репликации мтДНК Первая модель репликации мт ДНК - Strand displacement model предложена в 1982 г. (Clayton D.A.,1982). В ЭМ наблюдали структуры с протяженными оц участками, показана чувствительность продуктов репликации к нуклеазам, расщепляющим только оцДНК. Репликация начинается в ORI H и ORI L. Предложена модель Strand-coupled model (Yasukawa et al., 2005). С развитием методов микроскопии и молекулярной биологии (двумерный электрофорез с разделением по размеру и конфигурации) было обнаружено, что среди промежуточных продуктов репликации есть тета-структуры. Найдены дополнительные ориджины репликации. Предложена модель RITOLS. (Yasukawa et al., 2006). Показана чувствительность продуктов репликации к РНКазе.

44

45 Существует 3 модели репликации мтДНК: 1. Strand displacement model - однонаправленный ассиметричный синтез 2.Strand-coupled model - двунаправленный синтез с образованием θ- cтруктур 3. RITOLS (RNA Incorporated Through Out Lagging Strand) – промежуточные продукты содержат протяженные участки РНК PMID:

46 RITOLS (RNA Incorporated Through Out Lagging Strand) COSCOFA – conventional strand-coupled Okazaki-fragment associated PMID: RITOLS преобладает в культивируемых клетках, в печени и почках. COSCOFA преобладает в скелетных мышцах, сердце, в клетках, восстанавливающих мт ДНК после потери.

47 Как образуется РНК? Синтезируется как РНК- праймер Ранее образованная РНК продевается через репликативный комплекс, гибридизуясь с материнской цепью ДНК Репликация инициируется вблизи ORI H, отстающая цепь состоит из РНК, затем заменяется на ДНК: Печень цыпленка: А+С Печень мыши: В RITOLS (RNA Incorporated Through Out Lagging Strand) PMID:

48 Recombination-dependent replication Показана у Candida, предположительно так может реплицироваться ДНК в сердце человека. PMID:

49 1. Существует 3 модели репликации мтДНК: Strand displacement model – однонаправленный ассиметричный синтез с Ori Н, затем синтез второй цепи с Ori L. Вероятно, происходит редко. Strand-coupled model - двунаправленный синтез с образованием θ-cтруктур. RITOLS – отстающая цепь синтезируется в виде РНК, которая затем заменяется на ДНК. 2. Репликация мтДНК в сердце человека, вероятно, происходит параллельно с рекомбинацией.

50 PMID:

51 NCR CSB TAS NCR (D-loop) содержит: Ориджин репликации O H Участки регуляции репликации CSB (conserved sequence blocks) Участок терминации репликации TAS (termination- associated sequence) Промоторы для обеих цепей LSP и HSP1 D-loop PhePro CSB TAS Ori H LSP HSP1 Ori b

52