Использование культуры клеток растений для производства химических соединений

Вторичные метаболиты, их роль в жизни растений и ценность для человека Особенностью высших растений является их способность синтезировать разнообразные относительно низкомолекулярные соединения, обладающие, биологической активностью: сапонины, кумарины, стерины, каратиноиды, полифенолы, алкалоиды, витамины, хиноны и другие. Так как их присутствие в растительной клетке не строго обязательно для поддержания жизни, они получили название вторичные метаболиты (ВМ). Особенностью высших растений является их способность синтезировать разнообразные относительно низкомолекулярные соединения, обладающие, биологической активностью: сапонины, кумарины, стерины, каратиноиды, полифенолы, алкалоиды, витамины, хиноны и другие. Так как их присутствие в растительной клетке не строго обязательно для поддержания жизни, они получили название вторичные метаболиты (ВМ).

Вторичные метаболиты, их роль в жизни растений и ценность для человека вещества с антипитательными свойствами: лектины, ингибиторы протеаз, цианогенные гликозиды, таннины, изофлаваноиды, олигосахариды (защита от травоядных животных, микроорганизмов и вирусов) вещества с антипитательными свойствами: лектины, ингибиторы протеаз, цианогенные гликозиды, таннины, изофлаваноиды, олигосахариды (защита от травоядных животных, микроорганизмов и вирусов) ВМ с лекарственными свойствами: тритерпеновые гликозиды (стероидные сапогенины и сапонины женьшеня, солодки, аралии), изопреноиды тиса (противоопухолевые таксолы), «сердечные» гликозиды (карденолиды наперстянки, строфанта, ландыша); алкалоиды катарантуса, красавки, безвременника, эритроксилона, мака снотворного, барвинка, раувольфии, хинного дерева, табака (атропин, гиосциамин, скополамин, колхицин, кокаин, кодеин, морфин, папаверин, физостигмин, пилокарпин, хинин, хинидин, резерпин, D-тубокурарин и др.) ВМ с лекарственными свойствами: тритерпеновые гликозиды (стероидные сапогенины и сапонины женьшеня, солодки, аралии), изопреноиды тиса (противоопухолевые таксолы), «сердечные» гликозиды (карденолиды наперстянки, строфанта, ландыша); алкалоиды катарантуса, красавки, безвременника, эритроксилона, мака снотворного, барвинка, раувольфии, хинного дерева, табака (атропин, гиосциамин, скополамин, колхицин, кокаин, кодеин, морфин, папаверин, физостигмин, пилокарпин, хинин, хинидин, резерпин, D-тубокурарин и др.) ВМ с инсектицидными свойствами: пиретрины пиретрумов, хризантем, пижмы, ротенон из корней бобовых ВМ с инсектицидными свойствами: пиретрины пиретрумов, хризантем, пижмы, ротенон из корней бобовых Большинство пряностей, приправ, такие напитки, как чай, кофе и какао, обязаны вкусу и аромату ВМ, содержащихся в растениях, из которых их получают. Большинство пряностей, приправ, такие напитки, как чай, кофе и какао, обязаны вкусу и аромату ВМ, содержащихся в растениях, из которых их получают.

Для использования в хозяйственной деятельности ВМ экстрагируют из природного сырья или осуществляют химический синтез ВМ или их аналогов Для использования в хозяйственной деятельности ВМ экстрагируют из природного сырья или осуществляют химический синтез ВМ или их аналогов Однако зачастую уровень ценного ВМ в растении оказывается крайне низким, а его химический синтез дорогостоящий или чрезмерно сложен. Однако зачастую уровень ценного ВМ в растении оказывается крайне низким, а его химический синтез дорогостоящий или чрезмерно сложен. Природные популяции многих растений- продуцентов ценных ВМ немногочисленны, а культивирование затруднительно, нередко растения-продуценты характеризуются медленным ростом и длительным жизненным циклом. В некоторых случаях выращивание продуцентов затруднено из-за неподходящих климатических условий или отсутствия достаточного количества подходящих земельных ресурсов. Природные популяции многих растений- продуцентов ценных ВМ немногочисленны, а культивирование затруднительно, нередко растения-продуценты характеризуются медленным ростом и длительным жизненным циклом. В некоторых случаях выращивание продуцентов затруднено из-за неподходящих климатических условий или отсутствия достаточного количества подходящих земельных ресурсов. В связи с этим представляется экономически выгодным использование биотехнологий производства ВМ путем культивирования изолированных клеток растений in vitro. В связи с этим представляется экономически выгодным использование биотехнологий производства ВМ путем культивирования изолированных клеток растений in vitro.

Особенности биосинтеза вторичных метаболитов в культуре клеток растений В растении синтез ВМ, их транспорт и запасание находятся под строгим контролем всего организма, заложенной программой его развития. Имеются специализированные клетки, ткани и органы, в которых накапливаются ВМ. В растении синтез ВМ, их транспорт и запасание находятся под строгим контролем всего организма, заложенной программой его развития. Имеются специализированные клетки, ткани и органы, в которых накапливаются ВМ. Важнейшим условием получения культуры клеток растений является дедифференцировка, в результате которой специализированные клетки эксплантата могут терять и такое свойство, как способность к синтезу ВМ. Важнейшим условием получения культуры клеток растений является дедифференцировка, в результате которой специализированные клетки эксплантата могут терять и такое свойство, как способность к синтезу ВМ.

Особенности биосинтеза вторичных метаболитов в культуре клеток растений Характерной особенностью культивируемых клеток является то, что их деления, приводящие к увеличению клеточной биомассы, и синтез ВМ разобщены во времени. Накопление ВМ возрастает в фазе замедленного роста клеточной популяции (в конце клеточного цикла) и достигает максимума в стационарной фазе. Характерной особенностью культивируемых клеток является то, что их деления, приводящие к увеличению клеточной биомассы, и синтез ВМ разобщены во времени. Накопление ВМ возрастает в фазе замедленного роста клеточной популяции (в конце клеточного цикла) и достигает максимума в стационарной фазе. Имеет место положительная корреляция между накоплением ВМ и степенью дифференцировки в культуре клеток. Исследования четко показали, что компактные, медленно растущие культуры содержат целевые ВМ в больших количествах, чем рыхлые, быстро растущие культуры. Очевидно механизмы (генетические, эпигенетические) и условия, замедляющие рост клеток и клеточную пролиферацию, одновременно активируют ферменты вторичного метаболизма. Имеет место положительная корреляция между накоплением ВМ и степенью дифференцировки в культуре клеток. Исследования четко показали, что компактные, медленно растущие культуры содержат целевые ВМ в больших количествах, чем рыхлые, быстро растущие культуры. Очевидно механизмы (генетические, эпигенетические) и условия, замедляющие рост клеток и клеточную пролиферацию, одновременно активируют ферменты вторичного метаболизма.

Для производства ВМ в культуре клеток in vitro используют: Суспензионную культуру Суспензионную культуру Каллюсную культуру Каллюсную культуру Культуру стеблей (или эмбриогенную культуру) Культуру стеблей (или эмбриогенную культуру) Культуру корней: Культуру корней: - обычных корней; - «бородатых корней». Кокультивирование стеблей и корней. Кокультивирование стеблей и корней.

Культура «бородатого корня» Rubia tinctorum, активно растущая на безгормональной питательной среде MS

Добавление в питательную среду каких-либо промежуточных продуктов биосинтеза может способствовать превращению их в конечный продукт благодаря активности имеющихся в клетке ферментов. Явление химического превращения экзогенных веществ культивируемыми клетками растений, или их экстрактами получило название биотрансформация. Добавление в питательную среду каких-либо промежуточных продуктов биосинтеза может способствовать превращению их в конечный продукт благодаря активности имеющихся в клетке ферментов. Явление химического превращения экзогенных веществ культивируемыми клетками растений, или их экстрактами получило название биотрансформация. Субстрат для биотрансформации может быть натуральным или синтетическим, а конечный продукт – известным по биосинтезу в интактных растениях или новым, специфичным для культивируемых клеток. Биотрансформация субстрата в конечный продукт может осуществляться с помощью одного или нескольких ферментов. Субстрат для биотрансформации может быть натуральным или синтетическим, а конечный продукт – известным по биосинтезу в интактных растениях или новым, специфичным для культивируемых клеток. Биотрансформация субстрата в конечный продукт может осуществляться с помощью одного или нескольких ферментов.

Селекция и сохранение клеточных культур- продуцентов вторичных метаболитов Выбор вида растений, имеющего наиболее высокое содержание интересующего ВМ. Выбор вида растений, имеющего наиболее высокое содержание интересующего ВМ. Отбор лучших по этому показателю растений (генотипов) вида, которые используют в качестве источника эксплантатов для получения каллюсной культуры клеток, которую используют для получения суспензионной культуры. Отбор лучших по этому показателю растений (генотипов) вида, которые используют в качестве источника эксплантатов для получения каллюсной культуры клеток, которую используют для получения суспензионной культуры. Отбор наиболее продуктивных и стабильных клеточных клонов (линий) в процессе культивирования суспензии. Отбор наиболее продуктивных и стабильных клеточных клонов (линий) в процессе культивирования суспензии. Эффективность селекции продуктивных клеточных линий можно повысить с помощью мутагенов, отбора на селективных средах, с помощью генетической инженерии Эффективность селекции продуктивных клеточных линий можно повысить с помощью мутагенов, отбора на селективных средах, с помощью генетической инженерии

Подходы к увеличению выхода ВМ в культуре клеток растений Подходы к увеличению выхода ВМ в культуре клеток растений путями физиологической регуляции метаболизма клеток растений: Подходы к увеличению выхода ВМ в культуре клеток растений путями физиологической регуляции метаболизма клеток растений: - подбор питательных сред (состава и концентраций регуляторов роста, минеральных веществ, витаминов, сахаров, рН) - подбор питательных сред (состава и концентраций регуляторов роста, минеральных веществ, витаминов, сахаров, рН) - оптимизация режимов освещения, аэрации (соотношения СО 2 /О 2 ), температуры - оптимизация режимов освещения, аэрации (соотношения СО 2 /О 2 ), температуры - элиситация - элиситация - иммобилизация клеток - иммобилизация клеток - подбор типа и размеров биореактора - подбор типа и размеров биореактора

Элиситация В контексте производства ВМ с помощью культуры клеток растений элиситоры – вещества или другие факторы, способные индуцировать биосинтез ВМ в культуре клеток растений. В контексте производства ВМ с помощью культуры клеток растений элиситоры – вещества или другие факторы, способные индуцировать биосинтез ВМ в культуре клеток растений. Биотические элиситоры: экстракты бактериальных клеток, дрожжей, растений, хитин, хитозан Биотические элиситоры: экстракты бактериальных клеток, дрожжей, растений, хитин, хитозан Абиотические элиситоры: Абиотические элиситоры: - физические элиситоры: УФ-облучение, тепловой или холодовой шок - химические элиситоры: тяжелые металлы, ионы Ca 2+

Элиситация В результате изучения механизмов иммунитета растений было установлено, что в системе передачи экзогенного сигнала в клетку (англ. signal transduction system), который запускает клеточные процессы защитного ответа, наряду с реактивными формами кислорода, ионами Ca 2+, фосфоинозитидами важную роль играет жасмоновая кислота. Выяснилось, что индукция биосинтеза ВМ в культуре клеток растений под действием элиситоров сопровождается быстрой кратковременной аккумуляцией жасмоновой кислоты и ее метилового эфира метил жасмоната [Gundlach et al. 1992]. Это дало основание использовать данные соединения, а не сами элиситоры для индукции биосинтеза ВМ в культивируемых клетках растений. В результате изучения механизмов иммунитета растений было установлено, что в системе передачи экзогенного сигнала в клетку (англ. signal transduction system), который запускает клеточные процессы защитного ответа, наряду с реактивными формами кислорода, ионами Ca 2+, фосфоинозитидами важную роль играет жасмоновая кислота. Выяснилось, что индукция биосинтеза ВМ в культуре клеток растений под действием элиситоров сопровождается быстрой кратковременной аккумуляцией жасмоновой кислоты и ее метилового эфира метил жасмоната [Gundlach et al. 1992]. Это дало основание использовать данные соединения, а не сами элиситоры для индукции биосинтеза ВМ в культивируемых клетках растений.

Иммобилизация клеток Иммобилизация в инертном субстрате: обволакивание клеток альгинатом, агаром, коллагеном, полиакриламидом. Иммобилизация в инертном субстрате: обволакивание клеток альгинатом, агаром, коллагеном, полиакриламидом. Адсорбция клеток на инертном субстрате. Клетки прилипают к заряженным шарикам из альгината, полистирола, полиакриламида. Примером этого способа иммобилизации также может служить выращивание клеток внутри нейлонового сита, пенополиуретанового матрикса, полых волокон. Адсорбция клеток на инертном субстрате. Клетки прилипают к заряженным шарикам из альгината, полистирола, полиакриламида. Примером этого способа иммобилизации также может служить выращивание клеток внутри нейлонового сита, пенополиуретанового матрикса, полых волокон. Ковалентное связывание клеток с инертным носителем типа карбоксиметил-целлюлозы. Ковалентное связывание клеток с инертным носителем типа карбоксиметил-целлюлозы.

Промышленное производство вторичных метаболитов в культуре клеток и органов растений Промышленное производство в отличие от лабораторного предполагает использование биореакторов, которые отличаются от лабораторных: Промышленное производство в отличие от лабораторного предполагает использование биореакторов, которые отличаются от лабораторных: большими размерами большими размерами содержат различные специальные элементы, обеспечивающие содержат различные специальные элементы, обеспечивающие непрерывность технологического цикла, равномерность распределения клеток в реакторе, их аэрацию, непрерывность технологического цикла, равномерность распределения клеток в реакторе, их аэрацию, контроль температуры, контроль температуры, состава питательной среды, состава питательной среды, ее рН и других факторов, способных оказывать влияние на выход конечного продукта. ее рН и других факторов, способных оказывать влияние на выход конечного продукта.

Промышленное производство вторичных метаболитов в культуре клеток и органов растений Клетки растений в суспензии ( μм) в десятки, сотни раз крупнее клеток бактерий и грибов, их размеры меняются в процессе онтогенеза. Чем крупнее становится клетка, тем больше возрастает опасность ее механического повреждения в процессе перемешивания. Особенно подвержены механическим повреждениям культуры стеблей и корней Клетки растений в суспензии ( μм) в десятки, сотни раз крупнее клеток бактерий и грибов, их размеры меняются в процессе онтогенеза. Чем крупнее становится клетка, тем больше возрастает опасность ее механического повреждения в процессе перемешивания. Особенно подвержены механическим повреждениям культуры стеблей и корней Клетки растений тяжелее микробных и требуют эффективного перемешивания. Оседание их приводит к появлению «мертвых» зон в сосудах, в которых происходит быстрое накопление и старение клеток. Клетки растений тяжелее микробных и требуют эффективного перемешивания. Оседание их приводит к появлению «мертвых» зон в сосудах, в которых происходит быстрое накопление и старение клеток. Культура клеточных суспензий растений в основном состоит из агрегатов разного размера, что значительно увеличивает плотность культуры и затраты на ее перемешивание. Культура клеточных суспензий растений в основном состоит из агрегатов разного размера, что значительно увеличивает плотность культуры и затраты на ее перемешивание. У растительных клеток значительно ниже скорость роста по сравнению с микробными (время удвоения измеряется днями). У растительных клеток значительно ниже скорость роста по сравнению с микробными (время удвоения измеряется днями). Для начала производственного цикла при культивировании растительных клеток плотность инокулята должна быть не менее 5-10 %. Для начала производственного цикла при культивировании растительных клеток плотность инокулята должна быть не менее 5-10 %. Клетки растений in vitro по сравнению с микроорганизмами имеют более низкую интенсивность дыхания, Клетки растений in vitro по сравнению с микроорганизмами имеют более низкую интенсивность дыхания, Для культуры клеток растений используют значительно более сложные и дорогие питательные среды, чем для культуры микроорганизмов. Для культуры клеток растений используют значительно более сложные и дорогие питательные среды, чем для культуры микроорганизмов.

Промышленное производство вторичных метаболитов в культуре клеток и органов растений Различают два вида систем культивирования клеток: закрытую и открытую. Различают два вида систем культивирования клеток: закрытую и открытую. Для закрытой системы характерен периодический (накопительный) режим выращивания. Инокулят клеток помещается в определенный объем среды и в системе биореактора закрыт по всем параметрам, кроме газов, до конца выращивания. Для закрытой системы характерен периодический (накопительный) режим выращивания. Инокулят клеток помещается в определенный объем среды и в системе биореактора закрыт по всем параметрам, кроме газов, до конца выращивания. Открытые (проточные) системы культивирования клеток растений характеризуются поступлением свежей питательной среды, при котором отбирается не только старая питательная среда, но и часть урожая клеток. Питательная среда подается периодически, а старая удаляется. Клетки остаются в системе в течение всего цикла выращивания. Открытые (проточные) системы культивирования клеток растений характеризуются поступлением свежей питательной среды, при котором отбирается не только старая питательная среда, но и часть урожая клеток. Питательная среда подается периодически, а старая удаляется. Клетки остаются в системе в течение всего цикла выращивания.

Биореакторы с механическим перемешиванием культур различными импеллерами

Биореакторы барабанного типа

Биореакторы с пневматическим перемешиванием (барботированием)

Биореакторы одноразового использования с гидродинамическим перемешиванием

Промышленное производство вторичных метаболитов в культуре клеток и органов растений Уже в 1960 г была показана возможность выращивания биомассы табака в чанах из нержавеющей стали. В 1977 году в Японии биомассу табака Nicotiana tabacum выращивали в биореакторах объемом 20 м 3, оборудованных системой механического перемешивания. В настоящее время объем биореакторов для выращивания биомассы табака доведен до 75 м 3. Ее используют для производства сигарет с пониженным содержанием никотина. Уже в 1960 г была показана возможность выращивания биомассы табака в чанах из нержавеющей стали. В 1977 году в Японии биомассу табака Nicotiana tabacum выращивали в биореакторах объемом 20 м 3, оборудованных системой механического перемешивания. В настоящее время объем биореакторов для выращивания биомассы табака доведен до 75 м 3. Ее используют для производства сигарет с пониженным содержанием никотина. В 1974 г. Табата с сотрудниками (Tabata et al., 1974) впервые показали, что в каллюсной культуре воробейника Lythospermum erythrorhizon могут синтезироваться производные шиконина. В 1983 г. начато коммерческое производства шиконина японской компанией Mitsui Petrochemical Industry. Шиконин – красный нафтохиноновый пигмент, аккумулируемый в коре корней многих растений семейства Boraginaceae. Он обладает антимикробным, противовоспалительным, ранозаживляющим и противоопухолевым действием. В 1974 г. Табата с сотрудниками (Tabata et al., 1974) впервые показали, что в каллюсной культуре воробейника Lythospermum erythrorhizon могут синтезироваться производные шиконина. В 1983 г. начато коммерческое производства шиконина японской компанией Mitsui Petrochemical Industry. Шиконин – красный нафтохиноновый пигмент, аккумулируемый в коре корней многих растений семейства Boraginaceae. Он обладает антимикробным, противовоспалительным, ранозаживляющим и противоопухолевым действием.

Промышленное производство вторичных метаболитов в культуре клеток и органов растений В 1988 году в Японии началось коммерческое производство биомассы женьшеня, которую используют преимущественно в косметической промышленности и в виде пищевой добавки. В настоящее время в разных странах культуры клеток около ста видов растений используется в биосинтетической промышленности для получения важных для фармакопеи веществ. В 1988 году в Японии началось коммерческое производство биомассы женьшеня, которую используют преимущественно в косметической промышленности и в виде пищевой добавки. В настоящее время в разных странах культуры клеток около ста видов растений используется в биосинтетической промышленности для получения важных для фармакопеи веществ. О действительно широкомасштабном производстве ВМ с помощью методов культуры клеток растений можно лишь в отношении относительно небольшого количества продуктов: шиконина, таксола, берберина, а также биомассы женьшеня (лидерами являются компании Японии, а также США) О действительно широкомасштабном производстве ВМ с помощью методов культуры клеток растений можно лишь в отношении относительно небольшого количества продуктов: шиконина, таксола, берберина, а также биомассы женьшеня (лидерами являются компании Японии, а также США)