РАЗРАБОТКА ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО СПОСОБОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИФЕНОЛОВ И КОФЕИНА В РАЗЛИЧНЫХ СОРТАХ ЗЕЛЕНОГО И ЧЕРНОГО ЧАЯ 2007 Алексеева Анна Владимировна Научные руководители: проф., д.х.н. Карцова А. А., асп. Ганжа О. В.

(+)-Катехин ((+)-C) (-)-Эпикатехин ((-)-EC) (-)-Эпигаллокатехин ((-)-EGC) (-)-Эпикатехин галлат ((-)-ECG) (-)-Галлокатехин галлат ((-)-GCG) (-)-Эпигаллокатехин галлат ((-)-EGCG) Галловая кислота (GA) Кофеин (Caf) Важнейшие биологически активные компоненты чая 1

Методы анализа реальных объектов, содержащих полифенольные соединения ЧАЙ, ВИНО; ЛИСТЬЯ РАСТЕНИЙ; БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЖИДКОСТИ ЧЕЛОВЕКА (СЛЮНА, ПЛАЗМА КРОВИ, МОЧА) Определение общего содержания полифенолов ТСХ МЭКХ КЗЭ УФ Анализ катехинов, алкалоидов ЭХ Анализ полифенолов, аминокислот, сахаров, витаминов, органических кислот МС Анализ теафлавинов гликозидов, витаминов Фл Анализ полифенолов в биологических жидкостях человека ВЭЖХ Анализ летучих соединений, определяющих аромат чая, вина Для анализа полифенолов необходима дериватизация ГХ КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ЯМ Р СФ СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ ИК 2

J. of Chromatogr. А, Talanta, Analytica Chimica Acta гг Всего: 17 статей МС 70 % УФ, 20 % МС, 10 % ЭХ УФ 50 % КЗЭ, 50 % МЭКХ 3

4 МЕТОД КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА Определение ионогенных и нейтральных соединений Концентрирование пробы в режиме on-line Цель работы: Цель работы: Выяснение возможностей одновременного определения полифенолов и кофеина в различных сортах чая методом капиллярного электрофореза

Поставленные задачи: Получение спектрофотометрических характеристик полифенолов и кофеина Оптимизация условий разделения модельной смеси полифенолов в режиме капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) Выяснение возможностей мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) для одновременного разделения полифенолов и кофеина. Установление факторов, влияющих на селективность и эффективность разделения в этом режиме Количественный анализ реальных объектов и получение характеристических профилей Использование метода ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием как референтного для решения этой задачи 5

Оптимизация условий детектирования Соединение λ, нм ε, л ·моль -1 ·см -1 Caf (max) 3800 (max) EC (max) 2400(max) EGCG (max) 3100 (max) В качестве рабочей была выбрана длина волны детектирования 200 нм 6 Условия: спектрофотометр Shimadzu UV-1700; длина оптического пути = 1 см; концентрации водных растворов Caf, EC, EGCG – М

Электрофореграмма модельной смеси катехинов в КЗЭ КАПЕЛЬ 105, Капилляр: L общ = 60 см, L эфф =50 см, d внутр =75 мкм. Длина волны: λ = 200 нм Буферный электролит: 12,5 мМ тетрабората натрия (pH 9.2), 8 мМ β-циклодекстрина Проба: Cat, EC – по 10 мг/л, EGC, ECG, GCG, EGCG – по 20 мг/л Ввод: 30 мбар, 10 сек Напряжение: 20 кВ 7 pKa: 8.64, 9.41, 11.26, 13.26

Вариант мицеллярной электрокинетической хроматографии N –компоненты пробы, взаимодействующие с мицеллами Мицеллы и ЭОП движутся в противоположных направлениях. Компоненты пробы распределяются между фазой раствора и мицеллярной фазой, при этом константа распределения специфична для каждого сорта молекул пробы. C 12 H 25 OSO 3 - Na + Додецилсульфат натрия ККМ = 8,3 мМ 8

Зависимость электрофоретических подвижностей аналитов от концентрации детергента в буферном электролите где L общ – общая длина капилляра, см L эфф – эффективная длина капилляра, см U – величина рабочего напряжения, В t мигр – время миграции компонента, с 9 см^2/кВ*с

Зависимость коэффициента разрешения от концентрации детергента в буферном электролите где t 1 и t 2 – времена миграции первого и второго компонента, соответственно, мин w 1 0,5 и w 2 0,5 – ширина пиков на полувысоте, мин 10

Зависимость эффективности разделения от концентрации детергента в буферном электролите 11 где t R – времена миграции аналита, соответственно, мин W 0,5 – ширина пика аналита на полувысоте, мин N

Электрофореграмма модельной смеси катехинов, галловой кислоты и кофеина в МЭКХ Ведущий электролит: 25 мМ фосфатный буфер pH 7,0, 25 мМ додецилсульфата натрия Проба: смесь стандартов:C, EC – по 25мг/л, Caf – 12,5 мг/л, EGC, ECG, GCG, EGCG, GA – по 50 мг/л Ввод: 30 мбар, 10 сек. Напряжение: 25 кВ. Длина волны: λ = 200 нм 1212

Характеристические профили образцов чая 1 – Caf, 2 – EGC, 3 – EGCG, 4 – EC, 5 – GA, 6 – ECG 1313 Экстракт зеленого чая Экстракт белого чая Экстракт черного чая 45 mAU

1414 ПО 1 мкг/мл АналитКонцентрация, % масс. Белый чайЗеленый чайЧерный чай Caf0,79 ± 0,111,40 ± 0,221,21 ± 0,10 EGC1,24 ± 0,051,58 ± 0,100,24 ± 0,05 EGCG1,89 ± 0,111,45 ± 0,101,74 ± 0,12 EC0,37 ± 0,050,49 ± 0,060,26 ± 0,05 GA0,04 ± 0,010,07 ± 0,03 0,13 ± 0,04 ECG1,12 ± 0,100, 81± 0,120,10 ± 0,04 P = 0.95, n = 5 Количественный анализ различных сортов чая

? Полифенол + Казеин Комплекс EGCG Максимальная антиоксидантная активность (потенциал окисления – 720 мВ) Наибольшее содержание в чае (до 40 % от общего содержания полифенолов) 1515 Взаимодействие полифенолов с органическими и неорганическими соединениями

16 Изменение концентрации свободной формы EGCG от мольного соотношения белок/полифенол

λ, нм – казеин (5 мг/л) 2 – EGCG (3 мг/л) 3 – модельная смесь EGCG (3 мг/л) и казеина (20 мг/л) 17 Электронные спектры поглощения эпигаллокатехин галлата, казеина и их комплекса Условия: спектрофотометр Shimadzu UV-1700; длина оптического пути = 1 см; концентрации водных растворов Caf, EC, EGCG – М

18 5 % молока Зеленый чай Черный чай Влияние добавки молока в чай на его электрофоретический профиль 1 – Caf, 2 – EGC, 3 – EGCG, 4 – EC, 5 – GA, 6 – ECG

Анали т Концентрация, масс % Зеленый чай Зеленый чай с добавкой 5% молока Черный чай Черный чай с добавкой 5% молока Caf2,08 ± 0,191,10± 0,091,50 ± 0,110,95 ± 0,09 EGC1,71± 0,140,57± 0,06< 0.01 EGCG3,40± 0,300,55± 0,060,10 ± 0,01< 0.01 EC0,83± 0,080,28± 0,040,09 ± 0,010,07 ± 0,01 GA0,08± 0,020,04± 0,010,14 ± 0,020,06 ± 0,01 ECG2,32± 0,220,41± 0,050,18 ± 0,030,11 ± 0,02 19 Влияние добавки в чай молока на содержание полифенолов P = 0.95, n = 5

20 Изменение электрофоретического профиля чая при добавлении соли железа (III) Экстракт зеленого чая Экстракт зеленого чая с добавкой соли железа (III) 1 – Caf, 2 –C, 3 – EGC, 4 – EGCG, 5 - EC

21 Изменение площади пика EGCG на электрофореграмме при добавлении в пробу соли железа (III)

Зависимость R f аналитов от концентрации метанола в составе подвижной фазе 22 фронт старт b a R f = a/b R h = R f · 100 Пластины «Sorbfil» ПТСХ-АФ-В-УФ (ООО «Имид», г. Краснодар) П.ф. метанол - этилацетат ПО (Caf) 100 нг Caf EC

2323 Влияние состава элюента на селективность разделение кофеина и эпикатехина Содержани е метанола в п.ф., % об. α (Caf/EC) < 30< 0,73 > 70< 0,78 При содержании метанола 10% R f (Caf) = 0,17 Оптимальный состав элюента: метанол – этилацетат = 25 : 75 % об.

(1 – 7) – стандартные растворы кофеина, 8 – проба чая, 9 – проба чая с добавкой хлорида железа (III) Влияние добавки соли железа (III) на хроматографический профиль реального объекта 2424 Условия:Пластины ПТСХ-АФ-В-УФ «Сорбфил», п.ф. - CH 3 OH : CH 3 COOC 2 H 5 = 1 : Линия фронта растворителя Линия старта Fe 3+

Колонка: Supelco C 18 ; 150 ×4 мм Элюент: ацетонитрил – 1 % муравьиная кислота 25 Проверка корректности результатов количественного определения полифенолов и кофеина, полученных в режиме КЭ ОФ ВЭЖХ-УФ

Варианты изократического и градиентного элюирования в режиме ОФ ВЭЖХ 26 Режим элюирования (элюент А : элюент В, об.%) 0.0 мин15.0 мин 80 : : : : 855 : 95 Элюент А – ацетонитрил Элюент В – 1% муравьиная кислота

Оптимальные условия разделения модельной смеси кофеина и полифенолов в режиме ВЭЖХ Линейный градиент элюирования: 0.0 мин – 15% элюента А 15.0 мин – 5 % элюента А Элюент А – CH 3 CN Элюент В – 1% HCOOH 27 Колонка: Supelco С 18 ; 150 x 4 мм Детектирование: 254 нм ПО (Caf, GA) 1 мкг/мл ПО (EGC,EGCG) 10 мкг/мл

28 Caf GA EGCG Образец чая Метод количественного определения кофеина МЭКХОФ ВЭЖХ Чёрный чай «Ришехат» (Дарджилинг, Индия) 1,21 ± 0,061,24 ± 0,05 Белый чай «Серебряные иглы» (Китай) 2,43 ± 0,112,33 ± 0,10 (P = 0.95, n = 3) Использование метода ВЭЖХ в качестве референтного

ОбразецCafECEGCECGEGCGМетодСсылка Зеленый2,660,552,250,574,68 ВЭЖХ-УФ[1] Зеленый3,360,693,230,945,68 Черный3,290,500,380,37 Зеленый0,733,560,532,31 КЭ-УФ [2] Зеленый0,692,461,273,10 Черный0,220,320,890,92 Белый2,430,360,773,284,30 КЭ-УФ Наши данные Зеленый1,270,532,280,771,30 Черный1,210,260,240,101,74 Сопоставление с литературными данными 29 Концентрация выражена в % масс [1] P.L. Fernandez, M.J. Martin, etc. The Analyst V P [2] B.-L. Lee, C.-N. Ong. J. Chromatogr. A V P

Выводы 1. Изучены возможности различных вариантов капиллярного электрофореза с УФ-детектированием (КЗЭ и МЭКХ) для одновременного разделения смеси полифенолов и кофеина. Показано, что использование мицеллярного режима позволяет проводить их количественное определение с пределом обнаружения 1 мкг/мл. В качестве референтного использовался метод ОФ ВЭЖХ 2. Установлены зависимости электрофоретических подвижностей, эффективности и селективности разделения аналитов от концентрации мицеллообразующего агента – додецилсульфата натрия. Найдена оптимальная концентрация детергента - 25 мМ 3. В режиме МЭКХ (буферный электролит: 25 мМ фосфатный буфер (pH 7.0), 25 мМ ДДСН; 25 кВ; 200 нм) получены характеристические профили и проведен количественный анализ реальных объектов – различных сортов зеленого и черного чая. 4. Показано, что процессы комплексообразования полифенолов чая с казеином и ионами Fe 3+ приводит к заметному снижению содержания полифенольных соединений. 5. Предложен экспресс-вариант определения кофеина в составе чая методом ВЭТСХ с пределом обнаружения 100 нг

Схема биосинтеза полифенолов Нарингенин (Ar = п-гидроксифенил)

Ауреузидин (ауроны) Флоретин (дигидрохалконы) Бутеин (халконы) Катехин (флаван-3-олы) Лейкофизетинидин (флаван-3,4-диолы) Нарингенин (флаваноны) Кверцетин (флавон-3-олы) Дельфинидин (антоцианидины) Таксифолин (флаванонолы) Типичные представители флавоноидов

Типичные представители нефлавоноидов п-Кумаровая кислота (R = H) Галловая кислота Ресвератрол Кофейная кислота (R = OH)

Полифенолы Сложные эфирыПростые эфиры (-)-Эпигаллокатехин галлатНарингенин-7-глюкозид

Компоненты чая Фенольные вещества (до 30 %) Эфирные масла (0,02%) Алкалоиды (1-5 %) Аминокислоты и белки (16-25 %) Пектиновые вещества (2-6%) Пигменты (1-12 %) Минеральные вещества Витамины

Катехин г /100 г (-)-Эпигаллокатехин2,35 (-)-Галлокатехин0,37 (-)-Эпикатехин0,63 (+)-Катехин0,35 (-)-Эпигаллокатехин галлат 10,55 (-)-Эпикатехин галлат2,75 Среднее содержание флаван-3-олов в побеге цейлонского чая

п-Кумаровая кислота (R = H) Кофейная кислота (R = OH) Ресвератрол Желтый солнечный закат (Е110) Красный очаровательный (Е129) Важные соединения, содержащие фенольные гидроксилы Полифенолы нефлавоноидной группы Синтетические пищевые красители

[О] – ферменты, радикалы, катионы металлов Окисление полифенолов

КатехинСтруктурная формулаПотенциал окисления, мВ (-)-эпикатехин 835 (-)-эпигаллокатехин 760 (-)-эпикатехин галлат 740 (-)-эпигаллокатехин галлат 720 Потенциалы окисления катехинов

КатехинДегидродикатехин Окисление катехина ферментом пероксидазой в растительных объектах

Определение общей антиоксидантной активности зеленого чая

pKa: 9.98 pKa: 8.64, 9.41, 11.26, 13.26pKa: 8.72, 9.49, 11.23, pKa: 4,27, 8,68, 11,45 pKa: 4,62, 9,07

Предполагаемые структуры комплексов полифенол – Fe 3+?

Строение комплекса EGCG – Fe 3+

Зависимость селективности разделения аналитов от концентрации ДДСН в буферном электролите

EGCG Caf 306 nm 209 nm 273 nm 206 nm УФ-спектры анионов эпигаллокатехин галлата и кофеина Условия: растворы EGCG (400 мкг/л) и Caf (1 мг/л) в 10 mM боратном буфере pH 9,2 Спектрофотометр UV-1700 «Shimadzu»

4-диметиламиноцинамальдегида (ДМАЦА) Спектрофотометрическое определение полифенолов

Преимущества ВЭТСХ Экспрессность Возможность параллельно проводить анализ нескольких образцов Легкость смены элюента Высокая эффективность

Характеристика пластиныТСХВЭТСХ Толщина слоя сорбента, мкм Размер зерен, мкм Длина пробега п.ф., см Время разделения, мин Предел детектирования, нг Сравнение ТСХ и ВЭТСХ 27

t 0 – время выхода нейтральных сильно полярных соединений t R – время выхода соединений с промежуточной гидрофобностью t m – время выхода сильно гидрофобных соединений Механизм разделения в МЭХК

Органическая фаза Водная фаза pH < 7.0 Водная фаза pH < 7.0 Выделенные катехины ВЭЖХ анализ Фл 282 / 314 нм ПО 7 нг/мл Водная фаза pH > 7.0 Водная фаза pH > 7.0 КатехиныДифенилборат Трет-н-бутиламмоний или (н-октанол/н-гексан) H. Tsuchiya, M. Sato, H. Kato, H. Kureshiro, N. Tagahi // Talanta V. 46. P

Влияние потребления кипяченой воды, свежезаваренного чая и свежезаваренного чая, содержащего 10% молока, на кровоток, обусловленный расширением сосудов (flow-mediated dilation (FMD)) 1616 Вода Чай Чай + молоко Изменение FMD, %

Влияние катехинов на свойства растворов ДНК Дозовая зависимость характеристической вязкости ДНК при УФ-облучении в отсутствии (1) и в присутствии (2) (+)-катехина в растворе Спектры поглощения ДНК (1), (+)-катехина (2) и их смеси (3) Точками показана сумма спектров (1) и (2)

Метод разделения ДетектированиеРабочая длина волны, нм Объекты анализа ОФ ВЭЖХДетектор на диодной матрице210 Кофеин, никотиновая, хинолиновая кислоты и др. в кофе ОФ ВЭЖХДетектор на диодной матрице229Кофеин, 8-хлоротеофиллин ОФ ВЭЖХФотометрический детектор254 Кофеин, индопрофен, кетопрофен, и др. фармокологические препараты ОФ ВЭЖХДетектор на диодной матрице272Кофеин в чайных листьях ОФ ВЭЖХДетектор на диодной матрице231Пуриновые алкалоиды и катехины в чае ОФ ВЭЖХСпектрофотометрический детектор230, 254, 280Кофеин, кетопрофен, пропранолол МЭКХСпектрофотометрический детектор274 Кофеин и его метаболиты в напитках; таблетках; крови ОФ ВЭЖХ Спектрофотометрический детектор 272 Кофеин, теофиллин, теобромин в коле; плазме крови ОФ ВЭЖХ Спектрофотометрический детектор 280Кофеин и его 14 метаболитов в моче Определение кофеина в реальных объектах

Белок Содержание, % Общий белок100 Общий казеин 80 αs1-αs1-31 αs2-αs2-8 β-β-28 κ-κ-10 Молекулярный вес Число аминокислотных остатков (пролин) (17) (10) (35) (20) Пролин

αs1-Казеин κ-Казеин

Серинфосфат Белок Число остатков фосфорной кислоты αs1-αs1-11 αs2-αs2-8 β-β-5 κ-κ-1 Trp LeuVal Ser Pro

Казеин в форме мицелл

Казеин 150 мг/л EGCG 20 мг/л Казеин (150 мг/л) + EGCG (20 мг/л)

(+)-катехин [2R,3S]-2-[3,4- дигидроксифенил]-3,4-дигидро- 1[2H]-бензопиран-3,5,7-триол (-)-Эпикатехин [2R,3R]-2-[3,4- дигидроксифенил]-3,4-дигидро- 1[2H]-бензопиран-3,5,7-триол (-)-эпигаллокатехин [2R,3R]-2-[3,4,5- тригидроксифенил]-3,4-дигидро- 1[2H]-бензопиран-3,5,7-триол (-)-Эпикатехин галлат [2R,3R]-2-[3,4- дигидроксифенил]-3,4-дигидро- 1[2H]-бензопиран-3,5,7-триол 3- [3,4,5-тригидроксибензоат (-)-эпигаллокатехин галлат [2R,3R]-2-[3,4,5- тригидроксифенил]-3,4-дигидро- 1[2H]-бензопиран-3,5,7-триол 3- [3,4,5-тригидроксибензоат (-)-галлокатехин галлат [2S,3R]-2-[3,4,5- тригидроксифенил]-3,4-дигидро- 1[2H]-бензопиран-3,5,7-триол 3- [3,4,5-тригидроксибензоат

Концентрация органических лигандов – М. Концентрация ионов железа – М 1 – Резорцин, 2 - Пирокатехин Резорцин Пирокатехин

Оптимальные условия электрофоретического разделения смеси полифенолов и кофеина Система капиллярного электрофореза Капель-105; Капилляр: L общ = 60 см, L эфф =50 см, d внутр =75 мкм; Буферный электролит: 25 мМ фосфатный буфер pH 7.0, 25 мМ додецилсульфата натрия; Ввод: 30 мбар, 10 с; Напряжение: 25 кВ Рабочая температура - 20°С Длина волны: λ = 200 нм 13

17 Факторы, влияющие на содержание полифенолов в чайном напитке Условия произрастания чая Условия хранения (температура, влажность) Время заваривания чая Взаимодействие полифенолов с органическими и неорганическими соединениями

19 20 mAU EGCG Казеин Влияние добавки казеина на электрофоретический профиль полифенолов 20 mAU EGCG Ведущий электролит: 25 мМ фосфатный буфер (pH 7,0), 25 мМ ДДСН Ввод: 30 мбар, 10 сек. Напряжение: 25 кВ. Длина волны: λ = 200 нм Проба: EGCG (20 мг/л) Проба: смесь EGCG (20 мг/л) и казеина (6 мг/л)

Адсорбционная ТСХ Caf EC EGCGECG Caf Реальный объект АналитECECGEGCGCaf RfRf 0,73 ± 0,020,00 0,50 ± 0,02 H = 0,02 мм α(Caf/EC) = 0,68 R s (Caf/EC) = 3,3 R f =a/b – параметр удерживания аналита N=16·(a/w) 2 - число теоретических тарелок на разделяющем участке Н=a/N – высота, эквивалентная теоретической тарелке α=a 1 /a 2 – коэффициент селективности двух аналитов (1-й аналит – более удерживаемый) R s = 2·(a 2 -a 1 )/(w 1 +w 2 ) – коэффициент разрешения двух аналитов (1-й аналит – более удерживаемый) a 1, а 2 - пути, пройденные аналитами b – путь, пройденный элюентом от линии старта до линии фронта w 1, w 2 – ширина пятна аналитов 29 Условия: Пластины ПТСХ-АФ-В-УФ «Сорбфил» п.ф. - CH 3 OH : CH 3 COOC 2 H 5 = 1 : 3

МЭКХВЭТСХ 2,81 ± 0,102,97 ± 0,13 Содержание кофеина в чае «Кольца Джейд» (Китай) P = 0.95, n = 3 Условия: Пластины ПТСХ-АФ-А-УФ «Сорбфил» п.ф. - CH 3 OH : CH 3 COOC 2 H 5 = 1 : 3 Объем пробы чая - 4 мкл Количественное определение кофеина в чае методом ВЭТСХ 31