ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ. ЖИВОТНЫЕ. Лекция 9

Основные методы клеточной инженерии культивирование гибридизация реконструкция

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕРЕНИЯ. ЖИВОТНЫЕ. Лекция 9

Культуры животных. Среды ЕСТЕСТВЕННЫЕСРЕДЫ Амниотическая, асцитическая жидкость, эмбриональная сыворотка и пр. ИСКУССТВЕННЫЕСРЕДЫ Среда Эрла, среда Игла, среда Хенкса, среда 199 и др. Обязательное условие наличие незаменимых аминокислот, ростовых факторов (митогены, гормоны) и пр.

Культуры животных. Методы ПОВЕРХНОСТНОЕ МОНОСЛОЙНЫЕ КУЛЬТУРЫ методы выращивания на твердых питательных средах (подложках) ГЛУБИННОЕ СУСПЕНЗИОННЫЕ КУЛЬТУРЫ культивирование в жидких питательных средах

Культуры животных. Классификация. ПЕРВИЧНЫЕ получают практически из любого органа и культивируют до первого пересева ДИПЛОИДНЫЕ получают из эмбриональных тканей и сохраняют до 50 пересевов, характеризуются диплоидным набором хромосом ПЕРЕВИВАЕМЫЕ гетероплоидные культуры, существующие вне организма десятки лет

ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕРЕНИЯ. ЖИВОТНЫЕ. Лекция 9

Фундаментальные аспекты ОРГАННЫЕ КУЛЬТУРЫ для изучения закономерностей развития органов, механизмов гистогенеза для изучения способов сохранения жизнеспособности изолированных органов, межтканевых взаимодействий КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК для изучения роста и дифференцировки клеток для изучения межклеточных взаимодействий, обмена веществ и т. п.

Прикладные аспекты изучение механизмов действия лекарственных и косметических средств, пестицидов, консервантов и т. п выращивание, идентификации вирусов, получение вакцин ТЕСТИРОВАНИЕ для реконструкции различных тканей и органов (терапевтическое клонирование) для репродуктивного клонирования для получения соматических гибридов РЕКОНСТРУКЦИЯ и КЛОНИРОВАНИЕ как продуценты ценных веществ: гормонов, ферментов, моноклональных антител и др. БИОСИНТЕЗ и БИОТРАНСФОРМАЦИЯ

КЛОНИРОВАНИЕ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕРЕНИЯ. ЖИВОТНЫЕ. Лекция 9

Предыстория метода 1938 г г. – Х. Шпеман предложил эксперимент по переносу ядра

ЭКСПЕРИМЕНТ Г.В. ЛОПАШЕВА Георгий Викторович Лопашов ( ) 1948 г. разработал метод трансплантации ядер в яйцеклетку лягушки 1948 г. разработал метод трансплантации ядер в яйцеклетку лягушки

ЭКСПЕРИМЕНТ Р. БРИГГСА и Т. КИНГА Роберт Бриггс и Томас Кинг ( ) ( ) 1952 г. повторили и усовершенствовали метод трансплантации ядер 1952 г. повторили и усовершенствовали метод трансплантации ядер

ЭКСПЕРИМЕНТ Дж. ГЕРДОНА Джон Гёрдон (1933) 1962 г. использовал в качестве донора ядер специализировавшиеся клетки эпителия кишечника головастика. Выживало не более двух процентов клонированного потомства е гг. разработал метод серийных пересадок 1962 г. использовал в качестве донора ядер специализировавшиеся клетки эпителия кишечника головастика. Выживало не более двух процентов клонированного потомства е гг. разработал метод серийных пересадок

ЭКСПЕРИМЕНТ Л.М. ЧАЙЛАХЯНА и сотр г. первое клонирование млекопитающих (лабораторная линия мышей-альбиносов CBWA ) 1987 г. первое клонирование млекопитающих (лабораторная линия мышей-альбиносов CBWA ) Мышку клонировали из невзрачной тушки, которая 16 лет провела в холодильнике Чайлахян Л.М, Вепренцев Б.Н., Свиридова Т.А., Никитин В.А. Электростимулируемое слияние клеток в клеточной инженерии //Биофизика, 1987

ЭКСПЕРИМЕНТ Я. УИЛМУТА Ян Уилмут Долли (1944) ( ) Билл Ритчи Карен Майкок Кейт Кэмпбэлл ( ) Долли со своим первым ягненком Болли клонирование осуществлялось при помощи технологии ядерного переноса

Трансплантация ядер соматических клеток взрослых животных

КЛОНИРОВАНИЕ. ТЕХНИКА КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕРЕНИЯ. ЖИВОТНЫЕ. Лекция 9

перенос ядра из дифференцированной клетки в неоплодотворённую яйцеклетку в энуклеированную яйцеклетку с последующей пересадкой реконструированной зиготы в яйцевод сурогатной матери ТРАНСНУКЛЕОГЕНЕЗ

I этап Получение ядра для трансплантации II этап Получение энуклеированной клетки-реципиента III этап Получение реконструированной зиготы IV этап Клонирование ТЕХНИКА КЛОНИРОВАНИЯ

ОСНОВНЫЕ МЕОТДЫ МЕХАНИЧЕСКИЕ (использование микропипеток) ХИМИЧЕСКИЕ (использование химических веществ, например цитохалазина В) ФИЗИЧЕСКИЕ (переменное электрическое поле, УФ-излечение, лазер)

1 Этап. Получение ядра для трансплантации Донорская клетка отбирается у клонируемого животного и из нее при помощи микропипетки забирается ядро

2 Этап. Получение энуклеированной яйцеклетки Реципиентная клетка (неоплодотворенная яйцеклетка) отобранная у животного непосредственно после овуляции подвергается энуклеации (удаление ядра) МЕТОДЫ Микро- манипуляция Действие УФ

3 Этап. Реконструирование зиготы ядро с хромосомной ДНК клетки-донора соединяется с лишенной генетического материала яйцеклеткой (слияние)

МЕТОДЫ СЛИЯНИЯ. МЕХАНИЧЕСКИЕ. МИКРОМАНИПУЛЯЦИЯ 1. тонкой микропипеткой прокалывают зоны пеллюцида и плазматической мембраны и извлекают пронуклеусы 2.пипеткой, большего диаметра (12 мкм) в то же отверстие вводят диплоидное ядро донора. В этом случае меньше травмируется цитоплазма зиготы и транспортируемое ядро донора 1. тонкой микропипеткой прокалывают зоны пеллюцида и плазматической мембраны и извлекают пронуклеусы 2.пипеткой, большего диаметра (12 мкм) в то же отверстие вводят диплоидное ядро донора. В этом случае меньше травмируется цитоплазма зиготы и транспортируемое ядро донора Зона пеллюцида – наружная белковая оболочка яйцеклетки

ФИЗИЧЕСКИЕ – ЭЛЕКТРОСТИМУЛЯЦИЯ 1. первый разряд – для слияния клеток 2. второй – для стимуляции механизма дробления 1. первый разряд – для слияния клеток 2. второй – для стимуляции механизма дробления

ХИМИЧЕСКОЕ СЛИЯНИЕ Цитопласты отделяют от интактных клеток в градиенте плотности. Кариопластов выделяют через ряд операции по центрифугированию, разделению в градиенте плотности и т.д. Цитопласты отделяют от интактных клеток в градиенте плотности. Кариопластов выделяют через ряд операции по центрифугированию, разделению в градиенте плотности и т.д. цитохалазин В центрифугирование получение цитопластов и кариопластов

4 Этап. Процедура ЭКО или терапевтическое клонирование реконструированный зародыш вступает в стадию дробления

схема клонирования Эдди Лоренса

ФОРМЫ МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ РЕПРОДУКТИВНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ КЛОНИРОВАНИЕ

МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ получение клонов генов на основе техники рекомбинантных ДНК

клонирование репродуктивноетерапевтическое создание точной копии организма с использованием его генетического материала (клонирование исчезающих или вымерших видов; решение проблемы первичного бесплодия: коммерческое клонирование домашних животных и пр.) создание точной копии организма с использованием его генетического материала (клонирование исчезающих или вымерших видов; решение проблемы первичного бесплодия: коммерческое клонирование домашних животных и пр.) метод получения клеточных культур- трансплантатов (решение проблем трансплантологии; генная терапия; научные исследования в области молекулярно биологии и пр.) метод получения клеточных культур- трансплантатов (решение проблем трансплантологии; генная терапия; научные исследования в области молекулярно биологии и пр.)

РЕПРОДУКТИВНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ создание точной копии организма с использованием его генетического материала

Основные современные подходы при клонировании животных Фрагментирование предимплантационного эмбриона со стимуляцией последующего развития Фрагментирование предимплантационного эмбриона со стимуляцией последующего развития (таким путем были получены особи разных видов млекопитающих – мышей, коров, овец, лошадей) Пересадка ядер предимплантационных эмбрионов в энуклеированные клетки Пересадка ядер предимплантационных эмбрионов в энуклеированные клетки (клонирование земноводных – шпорцевой лягушки и пр.) Пересадка ядер соматических клеток взрослой особи в энуклеированные клетки Пересадка ядер соматических клеток взрослой особи в энуклеированные клетки (овечка Долли) Фрагментирование предимплантационного эмбриона со стимуляцией последующего развития Фрагментирование предимплантационного эмбриона со стимуляцией последующего развития (таким путем были получены особи разных видов млекопитающих – мышей, коров, овец, лошадей) Пересадка ядер предимплантационных эмбрионов в энуклеированные клетки Пересадка ядер предимплантационных эмбрионов в энуклеированные клетки (клонирование земноводных – шпорцевой лягушки и пр.) Пересадка ядер соматических клеток взрослой особи в энуклеированные клетки Пересадка ядер соматических клеток взрослой особи в энуклеированные клетки (овечка Долли)

Бластоциста приближается к стенке матки Бластоциста начинает внедряться (имплантироваться) под слизистую оболочку Имплантация практически закончена Предимплантационный зародыш помещают в матку суррогатной матери, либо развитие эмбриона останавливают Репродуктивное клонирование

Клонированные животные 1996 овечка Долли первая мышь первая корова первый козёл первая кошка первый кролик первые бык, мул, олень первый опыт клонирования с коммерческими целями (кошки) первая собака (афганская борзая по кличке Снуппи).

ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ КЛОНИРОВАНИЕ получения клеточных культур – трансплантатов 1. Оплодотворенная яйцеклетка (зигота) 2. Зигота делится надвое 3-4. Митотическое деление продолжается 5. Через 5-6 дней образуется бластоциста 6. Внутреннюю часть бластоцисты (ВКМ) помещают на питательную среду для получения стволовых клеток

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕРЕНИЯ. ЖИВОТНЫЕ. Лекция 9

Словарь Потентность Потентность – это способность стволовых клеток давать начало зрелым (специализированным, дифференцированным) клеточным линиям Тотипотентность – Тотипотентность – способность клеток при определенных условиях развиться до целого организма Плюрипотентность – Плюрипотентность – способность клеток дифференцироваться во все типы клеток, кроме клеток внезародышевых органов (плаценты и желточного мешка) Мультипотентность – Мультипотентность – способность клеток дифференцироваться в разные типы зрелых клеток одного вида ткани Полипотентность – Полипотентность – способность клеток давать до 5 линий развития Унипотентность – Унипотентность – способность клеток дифференцироваться только в один тип клеток Потентность Потентность – это способность стволовых клеток давать начало зрелым (специализированным, дифференцированным) клеточным линиям Тотипотентность – Тотипотентность – способность клеток при определенных условиях развиться до целого организма Плюрипотентность – Плюрипотентность – способность клеток дифференцироваться во все типы клеток, кроме клеток внезародышевых органов (плаценты и желточного мешка) Мультипотентность – Мультипотентность – способность клеток дифференцироваться в разные типы зрелых клеток одного вида ткани Полипотентность – Полипотентность – способность клеток давать до 5 линий развития Унипотентность – Унипотентность – способность клеток дифференцироваться только в один тип клеток

История открытия 1908 г. гистолог А.А. Максимов исследуя развитие клеток крови создал теорию стволовых клеток 1908 г. гистолог А.А. Максимов исследуя развитие клеток крови создал теорию стволовых клеток Александр Александрович Максимов

Стволовые клетки. Термин. недифференцированные клетки организма, способные делиться неопределенный период времени, равный жизни организма и, в подходящих условиях, дифференцироваться в любые клеточные типы тканей

Стволовые клетки. Свойства. 1 Пролиферация – способность к делению 2 Миграция – способность выходить из депо и циркулировать в биологических жидкостях организма 3 Хоминг – способность находить зону для репарации или построения ткани 4 Пластичность – способность дифференцироваться при миграции в зависимости от специфичности органа или ткани

Стволовые клетки. Классификации. по способности к дифференциации по способности к дифференциации по источнику их выделения по источнику их выделения Тотипотентные Плюрипотентные Мультипотентные Унипотентные Тотипотентные Плюрипотентные Мультипотентные Унипотентные Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) Фетальные стволовые клетки Стволовые клетки взрослого организма: а.) Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) б.) Мезенхимные стволовые клетки в.) Стромальные стволовые клетки г.) Тканеспецифичные стволовые клетки Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) Фетальные стволовые клетки Стволовые клетки взрослого организма: а.) Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) б.) Мезенхимные стволовые клетки в.) Стромальные стволовые клетки г.) Тканеспецифичные стволовые клетки

Характеристика: 1. могут генерировать до 300 популяций; 2. стабильный диплоидный кариотип; 3. высокая теломеразная активность; 4. минимальный фенотип; 5. рост клонами. Характеристика: 1. могут генерировать до 300 популяций; 2. стабильный диплоидный кариотип; 3. высокая теломеразная активность; 4. минимальный фенотип; 5. рост клонами. Эмбриональные СК выделяют из внутренней массы бластоцисты предимплантированного зародыша (гестация 5-10 дней) Получение: 1. из бластоцисты отбирают внутреннюю клеточную массу 2. помещают ее в чашку Петри с клетками-кормилицами 3. культивируют несколько дней в чашке до образования колоний эмбриональных стволовых клеток.Получение: 1. из бластоцисты отбирают внутреннюю клеточную массу 2. помещают ее в чашку Петри с клетками-кормилицами 3. культивируют несколько дней в чашке до образования колоний эмбриональных стволовых клеток.

Фетальные СК частично детерминированные клетки определенных тканей сформировавшегося фетуса (гестация от 6 до 24 недель) Характеристика : 1. могут специализироваться в 1-3 направлениях 2. частично маркированы МНС 3. активно пролиферируют Характеристика : 1. могут специализироваться в 1-3 направлениях 2. частично маркированы МНС 3. активно пролиферируют Получение: 1. из абортивного материала 2. помещают на питательные среды 3. культивируют несколько дней в чашке до образования колоний фетальных стволовых клеток.Получение: 1. из абортивного материала 2. помещают на питательные среды 3. культивируют несколько дней в чашке до образования колоний фетальных стволовых клеток.

Стволовые клетки. Перспективы. Клеточная трансплантология Клеточная терапия Клеточная терапия метод позволяет преодолеть: 1. дефицит донорских органов 2. высокую стоимость трансплантации 3. опасность осложнений 4. проблемы этического характера метод позволяет осуществлять: 1. тканевую и клеточную инженерию 2. косметологические процедуры 3. лечебные процедуры 4. заместительную терапию