Роль масс-спектрометрии высокого разрешения в идентификации метаболитов синтетических каннабиноидов Тимофей Соболевский, к.х.н. ФГУП «Антидопинговый центр»

2 | 13 ФГУП АДЦ Аккредитация ГОСТ Р ИСО/МЭК одна из 32 антидопинговых лабораторий в мире, аккредитованных ВАДА Производительность одно из первых мест в мире среди антидопинговых лабораторий по количеству проанализированных проб (18600 в 2013 году) скрининговый анализ включает более 400 соединений (анаболические стероиды, β 2 -агонисты, антиэстрогены, диуретики, стимуляторы, наркотики, каннабиноиды, кортикостероиды, β-блокаторы) в трех аналитических процедурах Методы анализа GC-MS, GC-MS/MS, GC-C-IRMS, UPLC-MS/MS, UPLC-OrbitrapMS

3 | 13 ФГУП АДЦ Оборудование приборный парк – один из самых больших в РФ, что позволяет разрабатывать методики и выполнять анализы не только для национального антидопингового агентства (РУСАДА), но и ряда других антидопинговых организаций, а также выполнять иные потоковые анализы (научные исследования, тестирование персонала и т.д.)

4 | 13 Синтетические каннабиноиды в ФГУП АДЦ JWH-018, начало работы, 2009 год Forensic Sci Int. 2010, 200(1-3), 141 Sobolevsky T, Prasolov I, Rodchenkov G. Detection of JWH-018 metabolites in smoking mixture post-administration urine. JWH-210, AM-2233, UR-144, AM-2201, 2012 год Drug Test Anal. 2012, 4, 745 Sobolevsky T, Prasolov I, Rodchenkov G. Detection of urinary metabolites of AM-2201 and UR-144, two novel synthetic cannabinoids. APICA, STS-135, 2014 год Drug Test Anal. (в печати) Sobolevsky T, Prasolov I, Rodchenkov G. Study on the phase I metabolism of novel synthetic cannabinoids, APICA and its fluorinated analog. AB-PINACA, 5F-AB-PINACA, PB-22F, AB-CHMINACA, MDMB- CHMINACA, MMB2201, 2014 год …

5 | 13 Методология Детектируемые соединения все синтетические каннабиноиды полностью метаболизируют в организме! Выделение активного компонента из курительных смесей с использованием препаративной ВЭЖХ Проведение ферментативных реакций in vitro метаболизм с помощью микросомальной фракции печени человека (первая фаза метаболизма) Идентификация метаболитов высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании масс- спектрометрией высокого разрешения – поиск метаболитов высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией низкого разрешения – изучение фрагментации, выбор характеристичных SRM-переходов Анализ образцов мочи выбор диагностическийй значимых метаболитов

6 | 13 Масс-спектрометрия Орбитальная ионная ловушка (Q) Exactive, Thermo Fisher Scientific разрешение 200 Да, точность масс < 5 ppm поиск метаболитов Тройной квадруполь TSQ Vantage, Thermo Fisher Scientific изучение фрагментации, выбор характеристичных SRM-переходов внедрение в методику скринингового анализа

7 | 13 Пробоподготовка и типовые условия анализа Пробоподготовка образца мочи ферментативный гидролиз β-глюкуронидазой (Escherichia Coli) в фосфатном буфере создание слабощелочной среды карбонатным буфером жидкостно-жидкостная экстракция диэтиловым эфиром упаривание органического экстракта перерастворение в смеси метанол/вода Условия инструментального анализа хроматографическая колонка Waters Acquity C18 BEH (100 мм x 2.1 мм, 1.7 мкм) градиентное элюирование элюенты: вода/метанол с добавлением муравьиной кислоты электро распылительная ионизация методика включает 120 соединений различных классов длительность анализа 10 мин

8 | 13 Поиск метаболитов STS-135 расчетное значение [MH] + = Да гидроксилирование моно/ди/три дезалкилирование окислительное дефторирование … и их комбинации NH + F NH O N NH O OH F N NH O OH OH OH F N NH O OH OH F N COOH NH O NH NH O NH NH O OH

9 | 13 Профиль метаболитов STS-135 ВЭЖХ-МСВР in vitro in vivo

10 | 13 Масс-спектры метаболитов STS-135 ВЭЖХ-МС/МС m/z R e l a t i v e A b u n d a n c e N COOH NH O N NH O OH F m/z R e l a t i v e A b u n d a n c e m/z R e l a t i v e A b u n d a n c e N NH O OH OH F N NH O OH OH F OH m/z R e l a t i v e A b u n d a n c e выбор характеристичных и селективных SRM-переходов

11 | 13 STS-135 в образце спортсмена

12 | 13 Газовая хроматография Основные сложности структура малопригодна для анализа методом ГХ низкая летучесть метаболитов мало предсказуемые спектры ЭИ низкая концентрация в образце интерференция с эндогенными соединениями (кортикостероиды) N CH 3 O O Si CH 3 CH 3 CH 3 Масс-хроматограмма моногидроксилированных метаболитов JWH-018, полученная методом ГХ-МС/МС после триметилсилилирования

13 | 13 Заключение использование микросомальной фракции ферментов печени человека для реакций in vitro позволяет получить широкий спектр потенциальных метаболитов синтетических каннабиноидов принимая во внимание особенности структуры этого класса соединений, метод высокоэффективной жидкостной хроматографии является предпочтительным масс-спектрометрия высокого разрешения позволяет однозначно идентифицировать метаболиты на фоне биологической матрицы используя данные, полученные методом ВЭЖХ-МСВР, возможно охарактеризовать потенциальные метаболиты методом тандемной масс-спектрометрии, установив характеристичные SRM-переходы для каждого из них анализ образцов, полученных в условиях in vivo, позволит установить, какие из метаболитов являются диагностическийй значимыми

14 | 13 Спасибо за внимание Тимофей Соболевский +7 (916)