ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА ПРОКАРИОТ И РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ План 1. Принципы изучения работы генов бак- терий. 2. Регуляция транскрипции гена галакто- зидазы у E.coli. Оперон.

1. Принципы изучения работы генов бактерий Исследования главного структурного и функционального элемента генома – отдельного гена начались в 60-х гг. ХХ века. В те годы не существовало методов определения нуклеотидной последовательности ДНК. Поэтому учёные строили гипотезы о строении гена на основе экспериментального изучения особен- ностей его функционирования. В гг. эти гипотезы были проверены и уточнены с помощью молекулярной генетики. Прямым критерием активности гена является наличие или отсутствие в клетке закодированного в нём белка. Так как большинство генов кодируют строение ферментов, можно су- дить о работе гена по активности соответствующего фермента. Искусственно вводя или убирая из питательной среды субстрат для данного фермента можно получить сведения относительно особенностей регуляции работы гена. Для проведения подоб- ных исследований лучше всего подходят микроорганизмы, в частности – бактериальные культуры.

1.1. Бактерии как объекты генетики Генетический аппарат бактерий не организован в хромосомы и не отделён от цитоплазмы ядерной мем- браной. Большинство генов находятся в большой коль- цевой молекуле ДНК. Кроме того, имеются кольца меньших размеров, в которых также есть гены. Эти кольца ДНК называются плазмидами (рис.1). Плазмиды могут реплицироваться автономно от бактериальной «хромосомы». Некоторые плазмиды могут интегрироваться в неё в определённых участках – сайтах. Такие плазмиды называются эписомами. Плазмиды могут переходить из одной клетки в дру- гие, перенося имеющиеся в них гены. Наличие в плаз- мидах генов устойчивости ко многим антибиотикам, создаёт большие проблемы в борьбе с болезнями.

Одним из преимуществ бактерий как объектов гене- тики является то, что в бак- териальном геноме каждый ген представлен единствен- ным аллелем. На его актив- ность не могут влиять дру- гие аллели этого же гена (их попросту нет). Поэтому чтобы узнать, какой аллель, нормальный или «дефект- ный», имеется у данного бактериального штамма, «включён» или «выключен» ген в данный момент, дос- таточно определить качест- во и количество конечного продукта – закодирован- ного в гене белка. Рис. 1. Бактериальная пдазмида. Электронная микрофотография (х 40000). Плазмида представляет собой кольцевую молекулу ДНК

Фенотип бактериального штамма – это, прежде всего, совокупность вырабатываемых химических сое- динений. «Дистанция» между генотипом и феноти- пом у бактерий гораздо короче, чем между генотипом и морфологическими признаками высших организмов (такими, например, как форма гребня у кур, форма и вес плодов у растений, размеры организма и т.д.). Именно потому, что у бактерий (и некоторых других микроорганизмов) можно непосредственно изучать различные биохимические мутации, они стали главными объектами молекулярной и биохимической генетики. Самой изученной бактерией является кишечная палочка – Escherichia coli (сокращённо E. coli), обитающая в кишечнике всех млекопитающих и не являющаяся болезнетворным организмом.

2. Регуляция транскрипции гена галактозидазы у E.coli. Оперон Культуру Escherichia coli можно поддерживать искус- ственно в виде жидкой суспензии клеток, или на ага- ризованной питательной среде. Для своего существо- вания E. coli требует поступления извне органических соединений. Из углеводов лучше всего она усваивает глюкозу. Ферменты для утилизации глюкозы выраба- тываются бактериальными клетками постоянно, а, следовательно, постоянно должны транскрибиро- ваться гены, в которых закодированы эти ферменты. Такие ферменты, вырабатывающиеся клеткой посто- янно, были названы конститутивными.

Если глюкозу заменить другим сахаром – дисахари- дом лактозой, то бактерии начинают вырабатывать - галактозидазу - фермент расщепляющий лактозу на моносахара – глюкозу и галактозу. Если подачу лакто- зы прекратить и вновь заменить её глюкозой, то выра- ботка -галактозидазы прекращается. Таким образом, -галактозидаза вырабатывается клеткой только тогда, когда она необходима. Белки, вырабатываемые клеткой не постоянно, а только при наличии соответствующего субстрата, называются факультативными. Вывод: ген галактозидазы способен «включаться» и «выключаться» в зависимости от наличия в суб- страта для данного фермента. Гены, способные ин- дуцироваться в необходимый момент, называются индуцибельными, а вещества, вызывающие включе- ние гена, – индукторами.

Французские биохимики Ф. Жакоб и Ж. Моно в 1961 г. провели опыты с мутантными штаммами E.coli, различаю- щимися по способности утилизировать лактозу. Использо- вались, также гибридные штаммы (мерозиготы), у которых были объединены мутации, связанные с нарушением индукции синтеза галактозы. Были получены следующие результаты: 1. Одновременно с синтезом галактозидазы всегда начинается синтез ещё двух ферментов – пермеазы (необходима для пе- реноса лактозы внутрь клетки) и трансацетилазы (непосред- ственно не участвующей в утилизации лактозы). Абсолютное количество этих ферментов в клетке может быть разным, но относительное соотношение (10 : 5 : 2) всегда остаётся постоянным. 2. Кроме мутаций структурных генов ферментов обнаружи- ваются мутации ещё в двух участках ДНК, нарушающие индук- цию. Мутация одного из этих участков делает синтез всех трёх ферментов конститутивным (ферменты вырабатываются посто- янно, даже тогда, когда в среде нет индуктора). Мутация в другом участке полностью блокирует синтез ферментов.

3. Конститутивная мутация находится в ДНК на некотором удалении от структурных генов ферментов. 4. Мутация блокировки синтеза расположена непосредственно перед структурными генами ферментов. Жакоб и Моно предложили следующие объяснения полученных данных. 1. Структурные гены -галактозидазы, пермеазы и трансацетилазы расположены рядом друг с другом и включаются одновременно при наличии в клетке индуктора (именно поэтому вырабатываются сразу три фермента). 2. Перед генами находится участок ДНК, мутация которого приводит к блокировке синтеза ферментов. Этот участок был назван оператором.

3. Ещё один ген, определяющий включение и выключение структурных генов, расположен на некотором удалении от них. В нём закодирован особый белок, имеющий химическое сродство и к оператору, и к индуктору. Этот белок был назван белком-репрессором, а его структурный ген – геном-регулятором. 4. Регуляция синтеза всех трёх ферментов происходит с помощью единого механизма следующим образом (рис.2).

Рис. 2. Взаимодействие репрессора, индуктора и оператора при регу- ляции транскрипции генов лактозного оперона E.coli А. В отсутствии индуктора репрессор связан с оператором, препятствуя связыванию РНК-полимеразы с промотором, который прилегает к оператору. Б. Индуктор связывается с репрессором, инактивируя его. РНК-поли- мераза связывается с промотором и начинает транскрипцию

В клетке всегда имеется небольшое число молекул белка-репрессора, который стремится связаться с опе- ратором, расположенным перед структурными генами. «Заблокированный» оператор становится недоступ- ным для прохождения молекул фермента РНК-поли- меразы в область структурных генов. Поэтому транс- крипция структурных генов не происходит. Если в питательной среде появляется индуктор, то имеющий к нему сродство белок-репрессор, соединя- ются с молекулами индуктора. Это изменяет структу- ру молекул белка-репрессора так, что они теряют срод- ство к оператору и отсоединяются от него. РНК-поли- мераза получает доступ на структурные гены фермен- тов. Начинается их транскрипция (синтез мРНК) и синтез ферментов. Ферменты расщепляют лактозу.

Если поступление лактозы в среду прекращается, то концентрация её, по мере утилизации ферментами, падает, происходит диссоциация комплекса субстрат- репрессор и высвобождение молекул белка-репрессо- ра. Высвободившиеся молекулы репрессора вновь присоединяются к оператору. Оператор вновь блоки- руется. Синтез ферментов прекращается. Участок ДНК, включающий оператор и следующие за ним структурные гены, был назван опероном. Таким образом, включение и выключение генов утилизации лактозы происходит по принципу обратной связи. Поступление в среду лактозы является сигналом для включения структурных генов, в которых закодированы ферменты утилизации лактозы. Полное исчезновение лактозы является сигналом для выключения этих генов.

Рассмотренный характер регуляции транскрипции является общим для генов, определяющих ферментативное расщепле- ние (катаболизм) различных органических веществ. Поэтому такая регуляция транскрипции была названа катаболической. Включение генов, в которых закодированы ферменты син- теза (реакции анаболизма), например, аминокислот, регули- руется тоже по принципу обратной связи. Регуляторами в этом случае являются конечные продукты. Молекулы свободного белка-репрессора химически инертны по отношению к опера- тору. При отсутствии в клетке конечного продукта (например, аминокислоты) оператор не заблокирован для РНК-поли- меразы. Происходит транскрипция генов и синтез ферментов анаболизма данной аминокислоты. Когда концентрация моле- кул аминокислоты достигает необходимого уровня, небольшая их часть соединяется с репрессором (происходит активация репрессора). Активированный репрессор приобретает хими- ческое сродство к оператору и блокирует его. Синтез фер- ментов анаболизма (и соответствующей аминокислоты) прек- ращается. Такой тип регуляции был назван анаболическим.

Характерной особенностью большинства факультативных ферментов, определяющих последовательную цепь биох- имических превращений, является то, что они появляются и исчезают одновременно. По-видимому, соответствующие структурные гены расположены последовательно друг за другом и имеют общие оператор и регулятор. Оперонная организация генома оказалась свойственной всем изученным бактериям. Ещё одними обязательными функциональными элемен- тами генома должны быть участки ДНК, на которых пре- кращается транскрипция (терминаторы). Они действитель- но были обнаружены в положении за структурными генами, как оперонов бактерий, так и генов эукариот.

Вопросы и задания 1.Почему бактерии – более удобный объект для изучения работы генов, чем высшие организмы? Какие признаки бактерий используются для изучения работы генов? 2. Какие данные свидетельствуют о наличии механизма включения и выключения генов в бактериальной клетке? Какие гены называются факультативными, какие – конститутивными? 3. Какие данные свидетельствуют о том, что струк-турные гены ферментов, выполняющие сопряжённые функции, объединены в один оперон? 4. Опишите значение всех компонентов оперона? 5. Чем отличается регуляция работы оперонов, обеспечива- ющих катаболические и анаболические реакции.