РАЗРАБОТКА И ВНЕДРЕНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ НОВЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СУБСТАНЦИЙ ИЗ ВТОРИЧНЫХ СЫРЬЕВЫХ ИСТОЧНИКОВ ПЧЕЛОВОДСТВА И ИХ ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ПТИЦЕВОДСТВЕ 2

1. Провести анализ химического, аминокислотного и витаминного состава биологически активных комплексов, полученных из продуктов пчеловодства в результате технологической переработки. 2. Определить генотоксические и антимутагены эффекты биологически активных комплексов на основе перги в бактериальных тест-системах (тест Эймса, SOS-хромотест). 3. Провести комплекс токсикологических исследований целевых продуктов на лабораторных животных. 4. Изучить физиолого-биохимическое воздействие кормовых добавок на организм птицы в лабораторных и промышленных условиях. 5. О боснова ть возможность использования целевых продуктов в птицеводстве и оздоровительных технологиях. 3

Процесс заготовки пчелиного хлеба Закладка обножки в соты Формирование обножки Сбор пыльцы Пчелиная перга в сотах Перга очищенная На производственный процесс 4

Усредненный химический состав продуктов пчеловодства (n=100) п/п Наименование показателя Ед. Изм.Метод испытания (обозначение НД) Перга Мерва 1. Массовая доля влаги%ГОСТ ,38,2 2. Массовая доля золы%ГОСТ ,010,94 3. Массовая доля сырого белка (протеина) в сухом веществе %ГОСТ ,833,3 4. Массовая доля сырой клетчатки в сухом веществе %ГОСТ ,0476,1 5. Массовая доля жира%ГОСТ ,042,1 6. Углеводный состав: Сахароза Глюкоза Фруктоза %%% Не обнаружено 23,7 10,52 Не обнаружено 1,78 3,64 7.Пестициды: ГХКЦ ДДТ и его метаболиты мг/кг МУ ГОСТ Не обнаружено 0, Микотоксины: Зеараленон Афлатоксин В1 Дезоксиваленон Патулин мг/кг -

1- герметичная теплоизолированная камера, 2- воздуховод подвода технологического воздуха, 3- воздуховод отвода технологического воздуха, 4- вентиляторы высокого давления, 5- электрокалориферы, 6- холодильная камера, 7 - озонатор воздуха, 8- утилизатор озона, 9- сепаратор-измельчитель, 10- вакуумная камера, 11- нагревательное устройство инфракрасного излучения, 12- трубопроводы, 13- водокольцевой насос по типу ВВН, 14- вакуумно-золотниковый насос по типу АВЭ, 15- мельница, 16- смеситель, 17- таблеточный пресс, 18- фасовочно-упаковочная линия 6 Технология получения субстанции «Перга очищенная» и целевых продуктов на ее основе 6

Технологическая схема получения кормовой добавки на основе продуктов пчеловодства 7

Схема получения биокомплексов на основе продуктов пчеловодства Таблица 4. Микробиологическая чистота целевых продуктов (n=8) Вид Допустимое количество Результат Общее число аэробных бактерий/ г Энтеробактерии/ г 1.000< 10 E. coli / готрицательный Сальмонеллы /10 готрицательный Плесень/споры/ г 90 Дрожжи / г < 10 Мерва заводская Продукты питания серии Винибис F Субстанция Мерва БАД Винибис С Природная перга Кормовая добавка «Алтын» Кормовая добавка Винивет Субстанция Перга лекарственная Субстанция Перга очищенная Технологический процесс * Разница достоверна Р< 0,05 Выполнено в институте аналитики (г. Бремен, Германия) 8

Биологически активные субстанции и целевые продукты Субстанция Перга очищенная Субстанция Мерва Лекарственный препарат Винибис Биологически активная добавка Винибис С Кормовая добавка Винивет Технологическая линия 9

Показатель Субстанция «Перга очищенная» Субстанция «Мерва» Кормовая добавка Винивет Кормовая добавка Алтын Единицы измерения мг/кгмкг/ сут. доза А0,7Не обнаружено 0, М.Е. В1В1 81,51, В2В2 5,53, РР51Не обнаружено 0, В5В5 36Не обнаружено 0,42105 В6В6 21Не обнаружено 0,21975 В 12 2Не обнаружено 0,02750 Вс Вс 1,20,80,08925 С1080Не обнаружено 11,21027(мг) D3D3 4Не обнаружено 0, E128,78,64155 H0,8Не обнаружено 0,00890 К3К3 39,47,119 Витаминный состав биологически активных субстанций и целевых продуктов (n=100) Выполнено в институте аналитики (Бремен, Германия), КНИТУ, КГАВМ им. Баумана, ВНИТИП РАСХН 10

Показатель Субстанция «Перга очищенная» Субстанция «Мерва» Кормовая добавка Винивет Кормовая добавка Алтын Единицы измерения%мг/сут. доза Аланин 1,840,40,137 Аргинин 0,899,33, Аспарагиновая кислота 2,10165,326 Валин 1,101,20, Гистидин 0,939,13,04950 Глицин 0,8418,46,073 Глутамин-1,40,461 Глутаминовая кислота 2,245,41,80 Глутатион (восстань.) -3,11,022 Изолейцин 0,923,61, Лейцин 1,502,30, Лизин 1,003,81, Метионин 0, О-фосфор-L-серин Не обнаружено 123,956 Триптофан 2025 Пролин 2,05 Серин 1,059,33,07 Тирозин 0,65 Треонин 0,971,30, Фенилаланин 0,881,20, Цистеин 2,44-0,0008 Аминокислотный состав биологически активных субстанций и целевых продуктов (n=100) 11

Показатель, единицы измерения Субстанция «Перга очищенная» Субстанция «Мерва» Кормовая добавка «Винивет» Кормовая добавка Алтын Влага, %6,058,2 Сырой протеин, %22,5033,330,1 Сырая клетчатка, %2,626,15,0 Массовая доля жира, % 1,042,11,9 Углеводы, % Глюкоза 23,71,782 Фруктоза 10,523,643,71 Микро- и макроэлементы мг/кг мг/сут. доза Железо 47,59102,83102,3325 Цинк 18,5359,5459,1 Марганец 19,8431,7731,6187,5 Магний 60 Кремний 200 Медь 0,0830,2430,24176,5 Кобальт--1,2 Молибден 1,2 Фосфор 4,7 г/кг 925 Калий 0,7 г/кг 1725 Кальций 3,2 г/кг 1575 Химический состав биологически активных субстанций и целевых продуктов (n=100) 12

Влияние биокомплекса на основе перги на рост штамма S. typhimurium ТА 100 концентрация биокомплекса, мкг/мл Контроль количество КОЕ на чашку 40±244±341±143±539±6 выживаемость,% ПО100 Исследование антимутагенных свойств биокомплекса на основе перги 13 Оценка мутагенного эффекта биокомплекса на основе перги в тесте Эймса. ПК - позитивный контроль (N- Метил-N-нитро-N-нитрозогуанидин - МННГ, 50 мкг/мл), НК – негативный контроль (спонтанный фон ревертантов), на данном и последующих рисунках: * - достоверно отличается от позитивного контроля, p0.05. Концентрация биокомплекса, мкг/мл SOS-индуцирующий потенциал биокомплекса на основе перги. ПК-позитивный контроль (митомицин С - МС мкг/мл), НК - негативный контроль (спонтанный фон индукции SOS-ответа). Концентрация биокомплекса, мкг/мл Выполнено: на кафедре микробиологии КФУ

А) Биоантимутагенное действие Б) Десмутагенный эффект Влияние биокомплекса на основе перги на мутагенную активность МННГ в тесте Эймса: А) вариант предварительной инкубации тостерных бактерий с исследуемым биокомплексом с последующим добавлением МННГ; Б) вариант одновременного действия биокомплекса и МННГ на клетки тостерных бактерий. ПК - позитивный контроль (МННГ, 50 мкг/мл), НК – негативный контроль (спонтанный фон ревертантов). Концентрация биокомплекса, мкг/мл 14 Концентрация биокомплекса, мкг/мл А) Концентрация биокомплекса, мкг/мл Б) Влияние биокомплекса на основе перги на SOS-индуцирующую активность МС: А) вариант предварительной инкубации тостерных бактерий E. coli PQ37 с исследуемым биокомплексом с последующим добавлением МС; Б) вариант одновременного действия биокомплекса на основе перги и МС на клетки E. coli PQ37. ПК - позитивный контроль: митомицин C (МС) – 100 мкг/мл, НК (пунктирная линия) - негативный контроль (спонтанный фон индукции SOS-ответа).

Биологические испытания целевых продуктов Токсическое действие Целевые продукты Кормовая добавка Винивет Биологически активная добавка Винибис С 1. Острая токсичность: Лабораторные животные Белые мыши (n=10) Белые мыши (n=55) Доза Взвесь порошка в воде мг/кг Наблюдение в течение 5 суток Взвесь таблеток в воде 1000, 3000, 5000, 10000, мг/кг Наблюдение в течение 5 суток Эффектотрицательный 2. Хроническая токсичность Лабораторные животные Белые мыши (n=10); Белые крысы (n=12) Белые мыши (n=20) Доза 250 мг в течение 30 дн; 3% от объема корма в течение 30 дней 250 мг в течение 30 дн Эффектотрицательный 3. Аллергизирующее действие Лабораторные животные Морские свинки (n=12) Морские свинки (n=16) Доза 2% от объема корма в течение 2 –х недель Взвесь таблеток в воде 0,2, 0,5, 1, 2 и 5% в течение 2 –х недель Эффектотрицательный 4. Раздражающий эффект на слизистую оболочку глаз Лабораторные животные Белые крысы (n=8) Белые крысы (n=6) Доза Суспензия 1:1 в дистиллирован-й воде Наблюдение через 2 часа и ежедневно в течение 1 недели 2% и 5% взвесь таблеток в дистиллированной воде Наблюдение ежедневно в течение 1 недели Эффектотрицательный 15

Токсическое действие Целевые продукты Кормовая добавка Винивет Биологически активная добавка Винибис С 5.Кожно-раздражающий и кожно-резорбтивный эффект Лабораторные животные Белые кролики (n=4) Белые крысы (n=6) Доза Суспензия 20 мг на кв.см выстриженного участка Размер аппликации 4 х 4 время экспозиции -4 часа Наблюдение -14 суток 2% и 5% взвесь таблеток в воде Размер аппликации 1 х 1 время экспозиции -4 часа Наблюдение -7 суток Эффектотрицательный 6. Ульцерогенное действие Лабораторные животные Белые крысы (n=12) Белые мыши (n=10) Доза 3% от объема корма в течение 30 дней Взвесь таблеток в воде 500, 1000, 2000 мг/кг (per os) Эффектотрицательный Биологические испытания целевых продуктов (продолжение) Выполнено на кафедре биологической и неорганической химии КГАВМ им. Баумана; в институте им. Арбузова 16

Основные зоотехнические результаты опыта на бройлерах (n=20) Показатели Группы 1-контроль Основной рацион (ОР) 2-опыт ОР с 5 кг/т Винивет 3-опыт ОР с 10 кг/т Винивет Биомасса, г в возрасте: суточные 42 в 7 дней 146,15±2,66152,57±2,65156,58 ±2,34 в 21 день 760,25±15,89765,26±16,43769,13±18,03 в 37 дней в том числе петушков курочек 2150,88 ±30, ,94±29, ,82±42, ,86±35, ,50±40, ,0±50, ,59 ±44, ,0 ±45, ,18±43,42 Сохранность поголовья, %97,2100 Среднесуточный прирост биомассы, г 56,957,356,9 Наименование группы Количество Средняя живая масса (г)Среднесуточный прирост (г) Исходные (15 сут. возраст) Через 115 дней (130 сут.возраст) 1. ОР+0,5% Винивет Самцы Самки ,3±9,1 320,6±8,7 6488±27,4 4663±19,3 53,6 37,8 2. ОР+1,0% Винивет Самцы Самки ,7±8,2 321,3±9,8 6260±22,7 4345±18,6 51,6 35,0 3. Контроль Самцы Самки ,1±8,3 322,1±9,3 6152±24,3 4162±16,7 50,6 33,4 Рост биомассы индеек (n=20) Разница достоверна Р< 0,05 ВЫВОД: кормовая добавка Винивет оказывает положительное влияние на рост биомассы цыплят- -бройлеров и индеек Выполнено во ВНИТИП РАСХН; КГАВМ Разница достоверна Р< 0,05 17

Морфологический и биохимический состав крови кур (n=10) Возраст птицы, сутки Эрит- роциты /л Лейкоци- ты, 10 9 /л Гемо- глобин, г /л Общ. белок, г/л Каротин, мг% Са, мг% Р, мг% Опытная группа 1603,325, ,15186,2 1903,525, ,16207,7 2203,726, ,17208,2 Контрольная группа 1603,424, ,15186,2 1903,424, ,14196,7 2203,324, ,15176,8 Норма 2,5-4, ,156-0, ,8-8,7 Состав крови и сыворотки Концентрация кормовой добавки по группам, % от массы корма Опытная 1(1%)Опытная 2(0.5%)Контрольная Общий объем клеток,% гемоглобин (г/л) эритроциты (10 12 /л) лейкоциты (10 9 /л) тромбоциты (10 9 /л) общ. белок (г/л) альбумины (г/л) мочевина (мг/л) 38,6±1,3 128,0±2,1 3,7±0,02 31,4±1,2 34,1±1,8 39,3±0,9 10,0±1,7 101,3±3,7 36,5±1,1 119,0±3,7 3,8±0,03 31,2±1,5 33,6±0,9 38,8±1,1 9,7±0,5 100±0,4 35,5±1,1 115,0±3,7 3,5±0,03 21,2±1,5 33,6±1,9 29,8±1,1 9,2±0,5 103,3±4,1 Клеточный и химический состав крови и сыворотки цыплят (n=10) 18

Морфо-биохимический состав крови индеек (n=10) Группа индеек Основные показатели по срокам исследований Эритроциты /л Лейкоциты 10 9 /л Гемоглобин г/л Общий белок г/л Глюкоза ммоль/л Общий кальций ммоль/л Неорг. фосфорр ммоль/л Исходные (возраст 29 суток) 2,71±0,0622,8±0,3172,3±1,0833,2±0,376,31±0,385,42±0,282,01±0,18 Через 30 дней после начала опыта Контроль 2,92±0,0927,3±0,4188,5±1,1234,5±0,716,53±0,135,56±0,132,19±0,07 Опыт 13,27±0,1329,3±0,37103,1±1,0337,5±0,637,39±0,086,12±0,142,92±0,06 Опыт 23,11±0,0828,8±0,2998,1±0,9736,7±0,587,12±0,116,75±0,152,88±0,09 Через 120 дней Контроль 3,05±0,0932,4±0,2390,3±0,9540,3±0,517,95±0,185,73±0,082,93±0,05 Опыт 13,31±0,0735,7±0,31107,2±0,8746,7±0,598,30±0,196,25±0,113,13±0,08 Опыт 23,21±0,0833,8±0,28103,3±0,6843,4±0,478,10±0,115,77±0,092,33±0,07 Разница достоверна Р< 0,05 ВЫВОД: применение кормовой добавки Винивет не проявляет патологического воздействия на кроветворение, улучшает основные параметры гемопоэза птицы Выполнено в КГАВМ им. Баумана 19

Показатели естественной резистентности кур (n = 10) Показателиопытная группаконтрольная группа Бактерицидная активность кожи, %54,4±0,548,2±0,6 Лизоцимная активность в сыворотке крови, %61,1±0,251,1±0,1 Индекс активности нейтрофилов в спонтанном НСТ-тесте 7,1±0,26,4±0,1 Индекс активности нейтрофилов в стимулированном НСТ-тесте 13,3±0,111,5±0,1 Показатель резерва ПР1,871,79 Коэффициент метаболической активности КМА0,870,79 Разница достоверна Р< 0,05. Выполнено в КГАВМ им. Баумана ВЫВОД: кормовая добавка способствует улучшению состояния обмена веществ и повышает показатели естественной резистентности 20

Состав белков сыворотки крови цыплят (n=6) Фракции белков До вакцинации Через 15 дней после вакцинации контрольопытконтрольопыт Общий белок, г/л 36,3±0,9937,9±0,7837,7±0,9939,1±1,01 Фракции белков, % альбумины 49,0±1,3146,0±0,9148,8±0,8342,2±0,87 α-глобулины 17,4±0,3116,0±0,2117,7±0,2715,7±0,18 β-глобулины 17,9±0,1917,0±0,3117,6±0,1817,4±0,21 γ - глобулины 15,7±0,21 х 21,0±0,18 х 15,9±0,17 LL 24,7±0,22 хл ВЫВОД: происходит улучшение иммунного статуса птицы за счет нарастание гамма- глобулиновой фракции Содержание сульфгидрильных групп и церулоплазмина в сыворотке крови цыплят (n=6) Группы Сульфгидрильные группы, мк МЦерулоплазмин, ед.оп.пл. Общие Белковые До вакцинации Опыт 21,3±1,024,2±1,03,1±0,3 Контроль 19,2±1,023,1±3,03,0±0,2 После вакцинации через 21 день Опыт 20,1±0,838,2±1,46,7±1,0 Контроль 18,3±0,634,3±1,16,5±0,9 Разница достоверна Р< 0,05 ОБЩИЙ ВЫВОД: кормовая добавка стимулирует иммуногенез у цыплят, повышая показатели гуморального и клеточного иммунитета Характеристики параметров Сульфгидрильные группы и церулоплазмин –показатели неспецифической резистентности Сульфгидрильные группы показывают состояние биосинтеза белка, в частности Иммуноглобулина; Церулоплазмин-белок сыворотки крови, связывающий и переносящий медь в живом организме. 21

Использование питательных веществ корма цыплятами-бройлерами (n=30) Показатель Группа 1 (к)23 Переваримость протеина % 91,992,792,9 Переваримость сухого вещества корма,% 73,973,276,8 Переваримость клетчатки, % 4043,244,4 Переваримость жира, %87,988,988,4 Использование азота кальция фосфорра 49, ,7 54,5 56,5 46, ,3 46,9 Доступность, % лизина метионина 89 80,1 88,8 78,3 88,7 79,4 Показатель Группа 1 (к)23 Переваримость протеина, %90,991,391,9 Переваримость сухого вещества корма, % 69,271,867 Переваримость клетчатки, %26,830,832,5 Переваримость жира, %76,689,483,4 Использование азота, %42,845,343,3 Доступность, %: лизина метионина 85 88,9 86,5 90,4 82,9 83,7 Использование, %: кальция фосфорра 71,1 35,4 62,8 30,7 74,2 35,9 ВЫВОД: улучшается усваиваемость основных компонентов корма Выполнено: ВНИТИП РАСХН Разница достоверна Р> 0,05 Использование питательных веществ корма курами-несушками (n=30) 22

Показатели Группа 1(к)2 –опыт 3-опыт Вода, %75,0173,0475,15 Протеин, %18,8721,3518,94 Жир, %3,408,396,12 Общее количество аминок-т,%,в т.ч.: 1. Заменимые аминокислоты, в т.ч.: Аланин Цистин Гистидин Аргигин Аспарагиновая кислота Тирозин Серин Глутаминовая кислота Пролин Глицин 2. Незаменимые аминок-ты, в т.ч.: Лизин Валин Метионин Изолейцин Лейцин Треонин Фенилаланин 18,09 10,99 1,077 0,22 1,034 1,13 1,63 0,63 0,73 2,90 0,87 0,77 7, ,96 0,57 0,88 1,48 0,86 0,80 19,29 11,72 1,14 0,23 1,13 1,26 1,86 0,65 0,74 3,10 0,82 0,79 7,57 1,70 1,05 0,58 0,96 1,56 0,91 0,81 18,1 10,96 1,09 0,22 1,01 1,16 1,66 0,70 0,71 2,98 0,67 0,76 7,14 1,63 0,98 0,54 0,93 1,50 0,86 0,70 Химический и аминокислотный состав мяса цыплят-бройлеров 23

Химический состав и энергетическая ценность мышечной ткани индеек (n=6) Показатели Группы индеек контрольопыт 1 опыт 2 Грудные мышцы (белое мясо) Влага, %74,2±3,7171,5±2,8072,4±3,51 Мин. вещества,%0,8±0,060,9±0,030,9±0,13 Жир, %1,4±0,051,7±0,041,6±0,08 Белок, %23,6±1,2125,9±1,1125,1±1,81 Энергетическая ценность, ккал 105,94118,83114,96 Бедренные мышцы (красное мясо) Влага, %74,1 ±0,9173,1±1,472,7±2,1 Мин. вещества,%0,9±0,070,9±0,081,0±0,05 Жир, %1,8±0,082,0±0,112,1±0,12 Белок, %23,2±0,9725,0±1,0624,2±1,76 Энергетическая ценность,ккал 109,18118,20115,99 ВЫВОД: улучшается качество мясной продукции Выполнено: ВНИТИП РАСХН, КГАВМ им. Баумана 24

Содержание витаминов в яйцах на начало продуктивного периода (кросс «Радонеж», 22,4 недели) Содержание витаминов в яйце кур, мкг/г: Группы 1 – контроль 2 – опыт 3 – опыт А9,0011,3213,75 Е189,91197,03281,84 В 2 в желтке 5,315,515,66 в белке 3,854,184,39 Каротиноиды 12,7718,1024,32 Содержание витаминов в яйцах (кросс «Бованс», 40 недель) Витамины Яйцо цельное Желток опытконт.опытконт. А, мг%0,360,280,980,76 Е, мг%1,201,013,02,6 Д, МЕ%15,6013,2126,023,0 Тиамин, мг%0,160,130,300,25 Рибофлавин (В 2 ), мкг% 167,0143,0556,0459,0 Выполнено: ВНИТИП РАСХН, КГАВМ им.Баумана ВЫВОД: улучшаются качественные характеристики яичной продукции 25

26 Практические результаты 26

27