ДИСЦИПЛІНА «ОСНОВИ БІОТЕХНОЛОГІЇ РОСЛИН» Лекція 1. Тема: Предмет та методи сільськогосподарської біотехнології. Зміст: 1.Біотехнологія як наука, її мета. - презентация

1 ДИСЦИПЛІНА «ОСНОВИ БІОТЕХНОЛОГІЇ РОСЛИН» Лекція 1. Тема: Предмет та методи сільськогосподарської біотехнології. Зміст: 1.Біотехнологія як наука, її мета та завдання; 2.Використання біотехнології в рослинництві та інших галузях народного господарства; 3. Історія розвитку біотехнології; 4. Культура ін вітро, основні терміни та поняття. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

2 Термін «біотехнологія» походить від грецьких слівbios - життя, techne – майстерність,logos- вчення. Біотехнологія - це сукупність технічних прийомів, що передбачають використання живих клітин або біологічних мікромолекул з метою вирішення конкретних або глобальних проблем біосфери та людства. Біотехнологія рослин – це сукупність технічних прийомів для модифікацій, поліпшення, створення та розмноження рослинних організмів, одержання з них корисних речовин. Фактично - це вирощування і маніпуляції з клітинами, тканинами і органами рослин поза організмом на штучних поживних середовищах у контрольованих умовах. 1 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

3 Основні переваги: проводити швидке розмноження у дуже великих кількостях; отримувати безвірусний матеріал; поліпшувати існуючі та створювати нові сорти рослин; вивчати складні процеси росту та розвитку рослин; створювати принципово нові біологічні технології для сільського господарства, медицини, харчової та хімічної промисловості. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

4 Основна мета досліджень біотехнології – це поліпшення існуючих та одержання нових сортів, видів, гібридів високопродуктивних форм рослин з поліпшеними показниками якості продукції і стійких до хвороб та шкідників (корисними ознаками для людини). Для цього у сучасній біотехнології виділено три основних напрями. технології, що ґрунтуються на використанні культури клітин, тканин та органів рослин ДНК-технології (молекулярно-генетичні методи аналізу рослин) отримання трансгенних рослин. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

5 ОСНОВНІ ЕТАПИ РОЗВИТКУ БІОТЕХНОЛОГІЇ РОСЛИН: І ЕТАП Г. Рехінгер (1893 р) одержав і вивчав калусні формування на коренеплодах цукрового буряка Г.Хаберландт чітко обґрунтував ідею про можливість вирощування окремих рослинних тканин на штучних живильних середовищах. Детальна розробка цього методу була здійснена у 30-х роках американцем Пилипом Уайтом і французом Роже Готре. ІІ ЕТАП 1949р. – Ф. Калінін почав роботи з культивування ізольованих тканин і органів рослин в Україні. 1957р. – Ф.Скуг і К.Міллер (США) довели можливість одержання коренів і пагонів з калусної тканини при дії цитокінінів та ауксинів. Ж.Морель (Франція) встановив дію гібереліну на проліферацію меристеми, її диференціацію і розвиток цілої рослини. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

6 рр. – К.Као (Канада), Е.Кокінг (Великобританія), Е Такебе (Японія) розпочали роботи з ізолювання та злиття протопластів і роки – Ю. Глєба, В.Сидоров, М.Півень, І Комарницький, Т.Пастернак (Україна) розпочали ряд робіт з ізольованими протопластами. Отримано соматичні гібриди та цибриди, розпочаті перші роботи з генетичної трансформації і роки – Е. Пірузян, В.Андріанова, В.Метт, І. Стехін (СРСР) – початок робіт з клонування генів і одержання перших трансгенних рослин р. – В США зареєстровано першу трансгенну рослину харчового використання – томат «Флейвр- Сейвр», що характеризується подовженим строком післязбирального зберігання рр. – кількість трансгенних сортів рослин у світі досягає 120 і вони займають 40 млн. га посівних площ рр. – посівні площі під трансгенними культурами в світі становлять більше 57 млн. га. ІІІ ЕТАП Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

7 ОСНОВНІ ПОНЯТТЯ ТА ТЕРМІНИ: в умовах «ін вітро» (від лат. vitrum означає скло). Цей термін вказує, що робота проводиться в стерильних і контрольованих умовах у лабораторному посуді (пробірках, колбах, чашках Петрі та ін.) термін «ін віво» означає, що перебіг процесів у живому організмі відбувається в природніх умовах. поміщення в умови ін вітро протопластів, клітин або експлантів вживається термін «введення в культуру» Експланти – будь-які частинки тканин, органів рослин, які вводяться в культуру (апекси пагонів або коренів, шматочки листків, бруньки, бутони, зародки, пиляки та ін.). Калусна тканина – це маса неспеціалізованих клітин, які утворюються в результаті пошкодження або при вирощуванні експлантат на штучному поживному середовищі. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

8 Тотипотентність (від лат. totus – весь, цілий, potencia – сила) – властивість клітин реалізувати власну генетичну інформацію, яка забезпечує їх диференціацію і розвиток до цілого організму. Тотипотентність клітин складає основу наукової ідеології біотехнології рослин Шляхи реалізації тотипотентності Пагони, корені Рослина- регенерант Калус Ембріоїди Клітина ембріоїдогенез органогенез Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

9 Лекція 2. Тема: Регулятори росту і розвитку рослин (РРР). Зміст: 1. Фітогормони в онтогенезі рослин; 2. Використання регуляторів росту рослин в практиці рослинництва; 3. Класифікація фітогормонів та методи їх отримання; 4. Основні типи РРР, їх фізіологічна дія та використання. Регулятори росту рослин (РРР) – це природні або синтетичні органічні сполуки, які активно впливають на обмін речовин вищих рослин, регулюють фізіологічні та морфогенетичні програми росту і розвитку рослинного організму. Регулятори росту, які продукуються самою рослиною, називаються фітогормонами 1 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

10 За типом дії РРР поділяють на: стимулятори та інгібітори. Проте такий поділ умовний, оскільки більшість із них в низьких концентраціях стимулює, а у високих - пригнічує ті чи інші процеси У практиці рослинництва використовують синтетичні РРР для: підвищення енергії проростання і польової схожості насіння; запобігання виляганню хлібів; регуляції плодоношення; підвищення врожайності; приживання саджанців і живців; полегшення механізованого догляду за рослинами та ін. Препарати: ТУР, емістим, метиур, дипромол, фарбізол, ресин, івин, капонин та ін. 2 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

11 Способи застосування синтетичних РРР: намочування насіння, живців у їх розчинах; обприскування вегетуючих органів рослин; найефективнішим вважається обприскування розчинами фіторегуляторів у поєднанні із засобами хімічного захисту рослин від хвороб і шкідників (так зване застосування бакових сумішей). Ауксини; Цитокініни; Гібереліни; Абсцизова кислота; Етилен; Брасиностероїди. 3 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

12 Ауксини Ауксини (від грецького аuxein - збільшуватись, рости) - група фітогормонів, які регулюють процеси поділу та розтягування клітин, сприяють формуванню коренів, провідних пучків, оплодня. Індольної природи: ІОК (індолілоцтова кислота) індолілпропіонова, індолілмасляна, індолілпіровиноградна, нафтилоцтова кислота. Неіндольної природи: 2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота (2,4-Д); 2,4,5-трихлорфеноксиоцтова кислота (2,4,5-Т); 2,3,6-трихлор-бензойна кислота (2,3,6-Т) та ін. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

13 Сучасне уявлення про фізіологічну дію ауксинів Класична дія ауксинів - посилення росту за рахунок стимуляції розтягнення клітин. ЮК активує роботу мембранної помпи іонів Н+, знижує рН позаклітинного середовища і посилює, тим самим, пластичність клітинних стінок. ІОК зумовлює явище апікального домінування, коли апікальна меристема гальмує ріст бокових меристем. Домінування верхівки класичний приклад того, як одна частина рослини контролює іншу за допомогою фітогормонів Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

14 Природу апікального домінування пояснюють декілька гіпотез: Верхівочна меристема (брунька) найбільш насичена ауксином, і є атрагуючим центром притягнення води та різних поживних речовин, яких не вистачає для бокових бруньок; Під дією ауксину синтезується інгібітор росту, який проникає у бокові меристеми і гальмує їх розвиток. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

15 Цитокініни Цитокініни були відкриті в результаті інтенсивної роботи з культурою тканин, яку проводив американський дослідник Ф.Скуг у роках. 3 хімічної точ­ки зору вони є похідними 6-амінопурину (аденіну) Природні цитокініни(15): Зеатин зеатинрибозид зеатинрибозидфосфат та ін. Синтетичні: кінетин ( одержують при автоклавуванні ДНК) бензиламінопурин /БАП/. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

16 Фізіологічна дія цитокінінів Цитокініни поліфункціональні у своїй дії на різних етапах росту і розвитку рослин. Сучасна наробка фактичних даних і їх обговорення дозволяють акцентувати увагу на двох основних ефектах фізіологічної дії цитокінінів: стимуляція процесів клітинного поділу і диференціації; затримка процесів старіння відокремлених органів; при взаємодії з ауксинами і гіберелінами цитокініни беруть участь у новоутворенні і диференціації органів ін вітро та ін віво, що пов'язують з їх впливом на біосинтез ДНК, РНК, білків, а також на перерозподіл продуктів обміну у рослині. цитокініни стимулюють розвиток латеральних точок росту (бокових бруньок), тобто беруть участь у подоланні апікального домінування. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

17 Природні (60): гіберелова кислота (ГК3 ) ГК 1; ГК 2 і т.д. Гібереліни були відкриті у 1926 році японським вченим Е.Куросавою при вивченні ураження рису грибом Gibberella. Екстракт гриба, а також виділена з нього у кристалічному вигляді речовина викликали сильні витягування рослин у довжину. Ці речовини були названі гіберелінами. (від назви гриба). 3 хімічної точки зору гібереліни відносяться до сполук дитерпеноїдів. Вихідними сполуками для їх синтезу у клітинах є ацетат і мевалонова кислота. Гібереліни Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

18 Фізіологічна дія гіберелінів Різнопланові експерименти з вивчення фізіологічної дії гіберелінів дозволяють зробити висновок, що гібереліни – компоненти систем, які регулюють ріст і розвиток рослин Найбільш виражена дія гіберелінів - їх здатність стимулювати ріст, видовження стебла за рахунок розтягування клітин ( а не їх поділу), що вказує на подібність із ефектом дії ауксинів. За допомогою гіберелінів відновлюють нормальний ріст карликових сортів гороху, кукурудзи або перетворюють карликову форму квасолі у витку ліану. На практиці гіберелінами обробляють коноплю та льон для підвищення виходу волокна. Другий класичний ефект дії гіберелінів пов'язаний з виходом насіння злакових із стану спокою. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

19 Важливе значення гіберелінів у процесі яровизації і цвітіння. Яровизація - реакція рослин на вплив низьких позитивних температур ( ° С) у певний період онтогенезу. Яровизація проявляється у прискоренні початку періоду плодоношення (цвітіння). Встановлено, що у ході яровизації підвищується рівень гіберелінів, що дозволяє холодову обробку замінити обробкою неяровизованих рослин гіберелінами. Гібереліни викликають партенокарпію - процес, при якому плоди розвиваються без запліднення. Для цього квітки рослин обприскують розчином гібереліну, що практич­но застосовується у виноградарстві (отримують без насіннєві ягоди великого розміру). Здатність гіберелінів зміцнювати у деяких рослин вираженість статі. Встановлено, що вміст гіберелоподібних речовин в рослинах огірка корелює із кількістю чоловічих квіток. Багаточисельними робо­тами показана маскулінізація (зсування статі у чоловічий бік) рослин родини гарбузових гід впливом гіберелінів. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

20 У 60-хроках в результаті незалежних досліджень А.Едікота та П.Уорінга були відкриті специфічні речовини-інгібітори: Абсцизова кислота (АБК) з хімічної точки зору відноситься до терпеноїдів із складною будовою. Дія АБК пов'язана із спокоєм бруньок і насіння, опаданням квіток, плодів, старінням і дозріванням. На практиці використовують для обприскування плодових, щоб викликати одночасне опадання плодів для скорочення часу при збиранні врожаю. Етилен - це газ, який добре розчиняється у воді, має характерний запах; хімічна формула Н2С=СН2. Відкриття етилену як гормону рослин відноситься до кінця XIX - початку XX ст., коли був виявлений вплив етиленового компоненту кам'яновугільного газу на передчасне скидання деревами листків, швидке в'янення квітів, та пригнічення росту пагонів. На початку 30-х років стало відомо, що етилен прискорює дозрівання плодів цитрусових. 3 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

21 Фізіологічна дія етилену: Класичний ефект дії етилену спостерігається у плодоовочевих сховищах або при тривалих морських транспортуваннях - перезрілі плоди посилюють дозрівання сусідніх, менш стиглих плодів. Важливим ефектом фізіологічної дії етилену вважається також стимуляція опадання листків - етилен впливає на розростання прошарку відокремлення, який знаходиться біля основи черешка листка. За допомогою низьких концентрацій кисню і високих концентрацій вуглекислого газу у середовищі проводять затримку дозрівання плодів при їх тривалому зберіганні. Кисень потрібен для утворення і дії етилену, а вуглекислий газ, навпаки, є його антагоністом. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

22 Брасиностероїди У 1979 році було знайдено і виділено у чистому вигляді з пилку ріпака Brassica napus L новий тип фіторегуляторів, які описані в літературі під назвою брасиностероїди Основна властивість брасиностероїдів (12 представників) - дуже висока фізіологічна активність. Якщо класичні фітогормони діють у концентраціях 10-6 – 10-5 моля, то брасиностероїди - в дозах моля Структуреі формули деяких брасиностероїдів: Брасинолід R1 = СН3, R2 = Н; Норбрасинолід R1 = R 2 = Н; Епібрасинолід R1= Н, R2 = СН3; Гомобрасинолід R1 = С2Н5, R 2 = Н; Доліхолід R1 " R 2 = СН3; Гомодоліхолід R1 - R 2 = СНСН3. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

23 Фізіологічна дія брасиностероїдів: Після обробки брасиностероїдами виявлена сильнодіюча стимуляція росту зернобобових, овочевих. плодових культур. Японські вчені У.Такематцу, А.Такеучі (1989) при обробці пшениці у фазі цвітіння водним розчином одного з брасиностероїдів одер­жали збільшення маси колоса і кількості зерна у колосі на 20-30%. Брасиностероїди сприяють збільшенню розмірів бульб картоплі. Вивчається їх дія на тварин і людину (з хімічної точки зору вони споріднені з гормонами линьки комах - екдистероїдів). Сучасні експериментальні дослідження свідчать про перспективність використання брасиностероїдів у сільському господарстві (у них невелика токсичність та дуже низькі норми витрат). Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

24 Лекція 3. Тема: Мікроклональне розмноження рослин. Зміст: 1. Способи регенерації рослин та етапи мікроклонального розмноження; 2. Експланти, їх походження і введення в культуру; 3. Активація розвитку пагонів та їх укорінення; 4. Перенесення рослин ін вітро в умови вільного існування; 5. Генетична стабільність при мікроклональному розмноженні та переваги і недоліки клонального мікророзмноження рослин. Основою мікроклонального розмноження – є регенераційна здатність тотипотентних рослинних клітин. 1 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

25 Регенерацію рослин у культурі ін вітро можна здійснити такими шляхами: Органогенез – утворення пагонів, коренів або рослин- регенерантів безпосередньо з експланту (апекса бруньки, листка, калусної тканини та ін.); Культура зародків (важливий засіб збереження нежиттєздатних зародків шляхом пророщування їх в умовах ін вітро, на штучному поживному середовищі); Соматичний ембріоїдогенез – утворення зарадкоподібних структур із соматичних клітин рослин. Класичним прикладом регенерації рослин шляхом прямого органогенезу є розмноження кімнатної рослини бегонії: зрізають повністю сформований непошкоджений листок, перевертають його нижньою поверхнею догори і нарізають листові живці розміром 1-2 см; листові живці розкладають зворотним боком листка або або висаджують вертикально у субстрат (пісок – торф 1:1), який попередньо стерилізують; Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

26 умови вирощування – 80-90% вологість, 18-21ºС – температура, обприскування фунгіцидом (фундазол, каптан); через 5-6 тижнів біля зрізів великих жилок зявляються молоді рослини-регенеранти, які після короткого підрощування пересаджуються для адаптації. мікроклональне розмноження (синонім – клональне мікророзмноження) – це масове нестатеве розмноження рослин у стерильних умовах, яке виключає появу генетично змінених форм. Формування зародкоподібних структур заново (через калусну тканину. Активація розвитку вже існуючих в рослині меристем, які знаходяться у верхівках стебла, в пазухових (сплячих) бруньках. ВИДИ Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

27 Технологія мікроклонального розмноження росли складається з таких основних етапів: Підбір експлантів і введення їх в культуру. Активація розвитку пагонів з експланту при підвищеній концентрації цитокінінів живильного середовища. Укорінення пагонів при збільшеній концентрації ауксинів в поживному середовищі. Переведення одержаних рослин із стерильних умов у грунт, їх адаптація (перенесення з умов ін вітро в умови ін віво). Термін «експлант» застосовують для назви вихідного шматочка рослини, який вводять в культуру ін вітро. В якості експлантів використовують верхівки пагонів, бокові бруньки, частинки кореня або листка, черешок листка, суцвіття, пелюстки квітів, гіпокотиль проростаючого насіння та інші частини рослин. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

28 Вибір експлантів: Краще всього використовувати матеріал вилучений з здорових, сильних рослин Верхівки пагонів, взяті з верхніх гілок дерева, мають більшу швидкість; розмноження, ніж верхівки з нижніх гілок; Більшість експлантів добре вводяться в культуру у фазу активного росту донорської рослини; Незрілі, молоді органи завжди більш пластичні з точки зору здатності до морфогенезу ін вітро, ніж старіючі, зрілі тканини та органи; При виборі експлантів слід віддавати перевагу меристематичним тканинам, оскільки вони легше виживають у культурі, мають більшу швидкість росту і тотипотентність; Розмір експланта теж визначає ступінь виживання ін вітро (крупніші за розміром верхівки пагона завжди краще виживають); Важливими компонентами успіху є очистка і стерилізація рослинного матеріалу перед введенням його в культуру ін вітро Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

29 ОСНОВНІ ЕТАПИ МІКРОКЛОНАЛЬНОГО РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН: І ЄТАП ВВЕДЕННЯ ЕКСПЛАНТА. Відібраний і простерилізований експлант (найчастіше меристематична тканина) вводиться в культуру на спеціальне поживне середовище. Такі меристематичні тканини знаходяться на кінчику основного пагона, в пазухових бруньках, зародку – класичних експлантах для мікроклонального розмноження рослин Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

30 ІІ ЕТАП ПРОЛІФЕРАЦІЯ ПАГОНІВ. Якщо наш експлант – верхівка пагона 0,25-0,30 мм у довжину, то в пазухах його зачаткових листочків знаходяться додаткові меристематичні тканини, які здатні формувати нові пагони. На другому етапі при підвищеній концентрації цитокінінів поживного середовища, долається ефект апікального домінування в умовах ін вітро і утворюється цілий пучок пагонів першого, другого, третього і т.д. порядку. Цей процес називається проліферацією пагонів ін вітро. При утворені пагонів, поживне середовище повинно містити цитокінінів більше ніж ауксинів. Це «золоте правило пагоноутворення» має винятки для деяких видів рослин. В культурі ін вітро використовують такі цитокініни: кінетин, зеатин, БАП; ауксини: ІОК, ІМК, НОК, 2,4-Д. Співвідношення цитокінін/ауксин підбирається для кожної культури експерементально. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

31 ІІІ ЕТАП УКОРІНЕННЯ ПАГОНІВ. Після того, як утворилось багато пагонів, їх необхідно укорінити і одержати повноцінні рослини. Основні індуктори коренеутворення (ризогенезу) – ауксини. Для формування коренів пагони відділяють і висаджують на поживне середовище, яке містить ауксинів більше, ніж цитокінінів. Це основне правило коренеутворення ін вітро, яке має свої винятки. Під впливом ауксинів стимулюється поділ клітин паренхіми пагона, що приводить до диференціації кореневих зачатків в його базальній частині. Стебло можна розрізати на 5-6 мікроживців, які у сприятливих умовах виростають до нормальних рослин. Процес дозволяє безперервно одержувати великі кількості рослин. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

32 ІV ЕТАП ПЕРЕНЕСЕННЯ РОСЛИН В УМОВИ ІН ВІВО. Основні вимоги: вибір ґрунтового середовища у яке переноситься рослина, здебільшого це суміш торфу з піском, перлітом або вермикулітом; перед висадкою у грунт корені рослин промивають у розчині фунгіциду (фундазол, каптан, бенолат); високий рівень вологості (90-100%) повітря, у якому буде знаходитись рослина після пробірки – найважливіший фактор перших тижнів вирощування рослини загартовують – готують до відкритого ґрунту: поступово знімають покриття з рослини і зменшують вологість до природної; при загартуванні рослин, як останній фазі адаптації, необхідно приділяти увагу оптимальному живленню рослин Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

33 Для позначення рослин, одержаних безстатевим шляхом, у 1903 році К. Вебером 6. був запропонований термін «клон» (від грецького klon – гілка, пагін, паросток) – ряд послідовних поколінь генетично однорідних організмів, які утворюються в результаті вегетативного розмножен- ня від одного загального предка. Виділяють три основні категорії змін: Генетичні, які пов'язані з плоїдністю, а також з хромосомними і генними мутаціями. Фенотипічні – пов'язані з морфологічними і анатомічними характеристиками рослин. Онтогенетичні – результат дезорганізації тканинних шарів у химерних рослин, або спонтанного зміщення груп клітин у вигляді ініціації росту адвентивних органів з різних шарів тканини. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

34 Клони, які одержані з меристем рослини-донора називають «мериклонами» Аналіз сучасних досліджень дозволяє зробити висновок, що для зниження частоти появи змінених форм у процесі мікророзмноження рослин необхідно: розмноження проводити на основі проліферації пазухових меристем; у процесі культивування вилучати всі бруньки калусного походження; вести розмноження по окремих мериклонах, щоб полегшити контроль за походженням рослин; регулярно перевіряти агробіологічні характеристики вибіркових екземплярів мериклонів. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

35 Переваги мікроклонального розмноження: Високий коефіцієнт розмноження (до 1 млн. одиниць садивного матеріалу за один рік, суниці, гербери, хризантеми та ін. рослин). Можливість розмноження протягом року незалежно від погодних умов. Наявність лабораторії і теплиці дозволяє це зробити. Створення «банку» неінфікованого цінного селекцій- ного матеріалу ( холодильник обємом 0,28 м 3 вміщує до 2 тис. культуральних рослин, що у відкритому ґрунті така ж кількість рослин займає від 5 до 6 га. Можливість широкого обміну рослинним матеріалом між регіонами і країнами. Зменшуються обєми перевезення матеріалу, легше вирішуються карантинні питання. Одержання безвірусного садивного матеріалу. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

36 Лекція 4. Тема: Біотехнологічні методи одержання безвірусного садивного матеріалу. Зміст: 1. Віруси рослин: структура, циркуляція у природі; 2. Одержання безвірусних рослин ін вітро; 3. Поєднання методу верхівочних меристем із термотерапією; 4. Хіміотерапія при оздоровленні рослин від вірусів 5. Діагностика рослин на наявність вірусів. Віруси – неклітинні форми життя, які мають власний геном (молекулу ДНК або РНК) і здатні до відтворення лише в живих клітинах хазяїна (рослини, тварини, бактерії), тобто є паразитами на генетичному рівні. Залежно від виду нуклеїнової кислоти розрізняють ДНК- і РНК-вмісні віруси, які зверху оточені білковою оболонкою – капсидом. Переважна більшість фітовірусів РНК-вмісні. 1 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

37 ГРУПИ МОЗАЇКИ Основна симптоматика мозаїк – нерівномірне (мозаїчне) забарвлення листків, яке обумовлене порушеннями пластидного апарату клітин; листки часто бувають зморшкуватими ЖОВТУХИ Характерні ознаки жовтух – загальний хлороз листків, які мають жовтуватий відтінок і скручуються. Листя надзвичайно насичується вуглеводами, що приводить до їх підвищеної жорсткості і крихкості Основні ознаки: У вірусів відсутні спеціальні пристосування для самостійної циркуляції в природі; У природі їх розповсюдження забезпечується через насіння, корені, бульби, цибулини, пилок, через грунт, рештки хворих рослин, воду, комах, при щепленні, підрізуванні, пасинкуванні або пікіровці рослин; Вірусні захворення різко знижують кількість і якість урожаю різних сільськогосподарських рослин. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

38 На практиці основними засобами боротьби з вірусними захворюваннями є: виведення стійких та імунних сортів с.г. культур знищення комах, бурянів, хворих рослин регулювання строків посіву та збирання с.г. рослин фізичні та хімічні засоби обробки насіннєвого та садивного матеріалу вакцинація та ін. метод культивування верхівочних меристем ін вітро у поєднанні з методами термо- і хіміотерапії Перші дослідники: У 1934 році один із засновників цього методу П.Уайт (США) повідомив, що віруси відсутні у кінцівках коренів рослин, уражених вірусом тютюнової мозаїки Подібні результати були одержані у 1949 році в дослідах М.Корнюа і П.Лімансеякий Ж.Морель і К.Мартен у 1952 році одержали безвірусні жоржини від уражених рослин. 2 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

39 Відсутність вірусів в апексах розміром 0,1 мм складає основу методу одержання оздоровлених (безвірусних) рослин з меристем in vitro Чому віруси відсутні у верхівочних меристемах? Існують такі спостереження: Віруси повільно розповсюджуються по рослині; Клітини меристем швидко діляться; Серед клітин верхівочних меристем відсутні міжклітинники, недостатньо налагоджена система плазмодесм, що ускладнює апопластний і симпластний шлях переміщення вірусу; Як правило, для ефективного звільнення від вірусів використовують шматочки меристем розміром 0,10-0,15 мм. Фактори, які мають стимулюючу або пригнічуючу дію на віруси: температура, різні види випромінювання, постійне магнітне поле, рН середовища, хімічні речовини. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

40 Термотерапія рослин (дія високих температур) – один із ефективних методів профілактики і лікування вірусних захворювань. Піонером застосування термотерапії для лікування рослин вважають П.Кобуса, який у 1889 році використовував гарячу воду проти вірусного захворювання цукрової тростини. Новий етап у розвитку термотерапії почався у 1935 році, коли американець Л.Кункель застосував гаряче повітря для лікування персика від жовтухи, дрібноплодності і розеточності. Метод термотерапії передбачає інактивацію вірусної інфекції – температурами 30-50ºC, які протягом певного Періоду експозиції не завдають шкоди фізіології самої рослини. Цей метод дозволяє брати для оздоровлення більші За розміром меристеми, які набагато краще виживають на поживних середовищах ін вітро (0,3-0,8 мм) 3 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

41 Отримання безвірусного садивного матеріалу картоплі завдяки поєднанню методів верхівочних меристем і термотерапії. Ця технологія складається з таких етапів: Термічна обробка матеріалу (бульб або укорінених верхівок) Виділення верхівочних меристем і регенерація з них рослин Індукція столоно- і бульбоутворення. Одержання мікробульб картоплі ін вітро. Застосування цього методу дозволяє - за 3-4 місяці одержати 2-3 тис. рослин придатних для висадки у грунт, тобто близько 20 тис. мікробульб за 9-10 місяців з однієї рослини. На експериментальній базі Інституту Картоплярства одночасно розмножують 30 тис. рослин ін вітро і одержують три врожаї на рік ( це становить близько 100 тис. мікробульб). Розроблений метод скорочує строки розмноження картоплі з 10 до 3-х років Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

42 Метод хіміотерапії базується на обробці рослин речовинами – інгібіторами вірусів або на їх додаванні до поживного середовища ін вітро. Вчені вишукують антивірусні препарати, які виробляються самими рослинами. Позитивні результати одержані в цьому напрямку при використані екстрактів лаванди, ромашки, шавлії та ін. лікарських рослин. Іманін – антибіотик, вилучений із звіробою, сприяє підвищенню стійкості томатів до деяких вірусних захворювань. Комплексне передсадивне застосування тіосечовини і гіберелінів для обробки бульб картоплі сприяє зниженню продукції Х і Y- вірусів у рослин. Велике значення має рН середовище при самореплікації вірусу. У дослідах на картоплі встановлено, що при значеннях рН близько 10 відбувається дезагрегація вірусів і втрата їх активності 4 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

43 Метод верхівочних меристем і хіміотерапія успішно доповнюють один одного при використанні панкреатичної РНК-ази, яку додають до поживного середовища. Відсоток здорових рослин-регенерантів на середовищі з РНК-азою у 1,5-2 рази вищий, ніж без неї. Щоб збільшити частку безвірусних меристемних рослин, до поживного середовища часто додають препарат «вірозол» (синтетичний рибоварин). Метод мікрощеплення застосовують при умові, що насіння цитрусових, персика і багатьох плодових культур не передає віруси і залишається здоровим. Рослини, які виросли у пробірці ін вітро з насіння, готують під бінокулярним мікроскопом для мікрощеплення – рослину зрізують, а на кінці залишка стебла роблять надріз, із яким щеплюють необхідний меристематичний експлант. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

44 Сучасний стан досліджень передбачає використання таки методів діагностики на наявність у них вірусів: Метод електронної мікроскопії (ідентифікація вірусів за допомогою електронного мікроскопу); індикаторний (біологічний) метод (діагностики вірусів основана на використанні рослин-індикаторів) Метод імунодіагностики (імуноферментний аналіз - виявлення комплексу антиген-антитіло). 5 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

45 Явище соматичного ембріоїдогенезу характеризується утворенням зарадкоподібних структур (ембріоїдів) нестатевим шляхом із соматичних клітин рослин. Розрізняють прямий і непрямий шляхи соматичного ембріоїдогенезу. Лекція 5. Тема: Регенерація рослин шляхом соматичного ембріогенезу Зміст: 1. Явище соматичного ембріоїдогенезу та його види; 2. Загальні принципи одержання калусної тканини; 3. Технологія вирощування рослин-регенерантів шляхом соматичного ембріоїдогенезу; 4. Природа сомаклональної мінливості; 5. Методи ідентифікації сомаклонів та практичне використання і перспективи сомаклональної мінливості. 1 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

46 Прямий соматичний ембріоїдогенез – це процес формування вегетативного зародка з тканин експланта без проміжної стадії утворення калусної тканини Непрямий соматичний ембріоїдогенез передбачає утворення ембріоїдів з клітин калусної тканини і складається з таких етапів: 1. введення експланта в культуру ін вітро; 2. стимуляція росту калуса і формування презародків; 3. індукція формування біполярних зародків з презародків. 2 Калус («калюс»), від лат. calus – мозоль – це особливий тип тканини рослин, яка утворюється на місці поранення і сприяє заживанню. Тканина закриває місце поранення і накопичує поживні речовини, необхідні для регенерації спеціального захисного шару. В калусній тканині можуть утворюватись зачатки органів, що доповнюють або відновлюють цілісність організму. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

47 Загальні принципи калусоутворення: Калусні клітини – це дедиференційовані клітини, в які перетворюються спеціалізовані і меристематичні клітини при їх культивуванні на специфічних поживних середовищах in vitro; Калусна тканина має вигляд аморфної маси тонкостінних паренхимних клітин без визначеної анатомічної структури. Клітини калусу мають велике ядро, високий вміст ДНК і РНК; деякі клітини здатні накопичувати крохмаль і речовини вторинного метаболізму; Калусні клітини можна невизначено довго вирощувати ін вітро. Для цього необхідні періодичні пересадки (пасажі) невеликої частини утворених клітин на свіже поживне середовище через кожні 3-4 тижні; Для індукції калусоутворення стерильні експланти (листки, черешки, сегменти стебел, корінців тощо) нарізують і поміщують на поживне середовище з високим значенням співвідношення ауксин/цитокінін: ауксину в середовищі повинно бути у 5-10 разів більше, ніж цитокініну; Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

48 При оптимально підібраному середовищі сегменти утворюють калус через 3-8 тижнів. Після перенесення невеличких частин калусних тканин на середовище з рівним співвідношенням ауксин/цитокінін, а потім - на середовище без фітогормонів формуються емброїдоподібні структури рослини-регенерант. 3 Процес формування ембріоїдоподібних структур на калусній масі (три стадії розвитку): Глобулярна, Серцевидна, Торпедовидна. Особливості соматичних ембріоїдів: Соматичні ембріоїди легко відокремлюються від калусної маси і пересаджуються на інше поживне середовище для одержання з них рослин-регенерантів. Ембріоїди виникають з поверхневих клітин і мають одноклітинне походження. Ембріогенні клітини відрізняються більш щільною цитоплазмою, відносно великим ядром і значною кількістю рибосом. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

49 Рослини-регенеранти, які одержані шляхом соматичного ембріоїдогенезу, називають сомаклонами (синонім – сомаклональними варіантами). У 1981 році Р.Чалеф запропонував символ R для рослин-регенерантів, одержаних з культур клітин або тканин. Самозапилені нащадки рослини R0 позначаються R1; наступні покоління від самозапилення – R2, R3 і т.д. Поява сомаклонів, що мають генетичні відмінності від материнської рослини, обумовленна існуванням сомаклональної мінливості. Це явище було відкрите на початку 80-х років і вважається одним із перспективних напрямків індукції мінливості в культурі ін вітро. Невизначеність генотипів ембріоїдів, з яких утворюються сомаклональні варіанти, обумовлює їх потенційну цінність для поліпшення існуючих сортів рослин. 4 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

50 Природа виникнення сомаклональної мінливості пояснюється двома основними причинами: генетична гетерогенність соматичних клітин експланта вихідної рослини. Перша причина повязана генетичним різноманіттям соматичних клітин у природі (різний рівень плоїдності, химеризм). В клітинах меристемних тканин рослин на різних етапах онтогенезу може відбуватися ендореплікація хромосом і формування тканин з різним рівним плоїдності; генетична і епігенетична мінливість, що індукується умовами культивування. Існує класифікація типів химерних тканин рослин: Мозаїчні (гіперхемерні) – генетично різні тканини утворюють мозаїчну структуру. Секторіальні – різнорідні тканини розташовані окремими великими ділянками. Периклинальні – тканини, розташовані одна над одною. Мериклинальні – суміш сектроріальних і периклинальних ділянок тканин. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

51 Методи ідентифікації сомаклонів: Морфологічний; Цитогенетичний; Метод білкових маркерів Вивчення фрагментів ДНК): Морфологічний метод базується на ідентифікації сомаклонів за зовнішніми (морфологічними) ознаками: висота рослини, розмір, форма і колір листків, квітів, плодів, насіння, фертильність, урожайність, стійкість до хвороб та ін. Цитологічний аналіз передбачає вивчення числа і морфології хромосом сомаклонів, що дозволяє одержати найбільш переконливі і предметні докази поліплоїдності або міксоплоїдності рослин-регенерантів. Для цитогенетичних досліджень використовують тиснуті препарати з молодих корінчиків рослин або пророслого насіння довжиною 1-2 см. 5 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

52 Методи білкових маркерів базуються на генетичній обумовленості синтезу білків (ферментів), що дозволяє використовувати їх як специфічні індикатори генотипу. Електрофоретичні варіанти білків та ізоферменти – це маркери, за якими тестують належність рослин до виду, біотипу, сорту; встановлюють ступінь спорідненості рослин; виявляють генетичну гетерогенність морфологічно однорідних популяцій. Аналіз ДНК шляхом рестрикції і гібридизації широко використовують для виявлення і вивчення організації послідовностей ДНК після їх електрофоретичного розділення. Аналіз специфічних нуклеотидних послідовностей, їх консервативних повторів, які гомологічні певному ДНК- зонду, допомагає «ловити» генетичні перебудови у сомаклонів. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

53 Лекція 6. Тема: Одержання та культивування протопластів рослин. Зміст: 1. Виділення і культивування протопластів; 2. Гібридизація соматичних клітин шляхом злиття ізольованих протопластів (соматична гібридизація рослин); 3. Методи злиття протопластів; 4. наліз соматичних гібридів Протопласти (від грецьк. protos – перший, plastos – утворений, виліплений) – клітини, які позбавлені своєї клітинної оболонки. Їх можна характеризувати як відокремлені мембраною ядро і цитоплазматичні утворення з власною структурною цілісністю і здатністю здійснювати активний метаболізм, біосинтез і трансформацію енергії. 1 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

54 Методи виділення протопластів: 1. Механічний Протопласт у гіпертонічному розчині віддає воду, зменшується в обємі і відокремлюється від клітинних стінок (згортається у клубок). Такого роду методи ізоляції протопластів називають механічними Недоліки: Виділяється невелика кількість протопластів; Використовуються тільки ті тканини, в яких відбувається екстенсивний плазмоліз; Важко одержати протопласти з меристемних тканин; Протопласти зазнають сильного осмотичного шоку; Метод довготривалий і трудомісткий. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

55 2. Ензиматичний Ензиматичний спосіб був запропонований англійським вченим Е.Кокінгом, який у 1969 році за допомогою спеціальних ферментів руйнував целюлозно-пектинову оболонку і одержував «голі» клітини – протопласти. Після вдалих робіт І. Такебе (1971) ензиматичний метод знайшов широке застосування при виділенні протопластів у багатьох лабораторіях світу Переваги ензиматичного методу: Одночасно можна виділяти і працювати з великою кількістю протопластів (106 – 109); Протопласти не зазнають сильного осматичного ущільнення, вони більш інтактні і непошкоджені; Метод відносно швидкий. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

56 Соматична гібридизація (синонім – парасексуальна гібридизація) – гібридизація соматичних клітин шляхом злиття їх ізольованих протопластів (англ. Fusion of protoplasts). 1. Хімічний метод передбачає обробку протопластів поліетеленгліколем (ПЕГ), а потім – буферним розчином з високим вмістом Са2+, рН 10,5. Додавання ПЕГ до батьківських протопластів приводить до їх злипання в результаті дегідратації. Поглинання вільної води призводить до утворення Отворів по всій поверхні плазмалеми і відбувається перетікання внутрішньоклітинного матеріалу. 2 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

57 2. Метод електрозлиття протопластів (Ватс Д, Кинг Дж., 1984; Хан-Хагердал В., Борнман Х., 1986). Протопласти суспензують між двома електродами. При дії змінного струму проходить діелектрофорез і протопласти шикуються у ряд таким чином, що приєднуються своїми полярними поверхнями один до одного. Потім накладають сильний імпульс постійного струму (600в/см мкс), який обумовлює утворення отворів ущільнених мембранах. У місцях контактів протопластів утворюються містки, по яких відбувається перетікання цитоплазм у вигляді міжпротопластного обміну. При злитті протопласта і цитопласта (протопласт без ядра) утворюється соматичний цибрид. Таким чином, генетична основа соматичного цибрида може складатися з елементів двох цитоплазмонів і одного із ядер батьківських протопластів Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

58 Для підтвердження гібридної природи отриманих у результаті злиття клітинних агрегатів рослин-регенерантів необхідне проведення цитологічного, біохімічного і молекулярногенетичного аналізів: Цитологічний аналіз. Цей метод достовірний, особливо для міжтрибних, міжродинних гібридів, для батьків яких властива докорінна морфологічна відмінність хромосом.. Біохімічний аналіз. Застосовують для аналізу міжвидових гібридів. Вивчають їх за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі з наступним фарбуванням білків із визначеною ферментативною активністю – це є найпростішим і найефективнішим засобом біохімічного аналізу парасексуальних гібридів. Молекулярно-генетичний аналіз. Використання рестрикційного аналізу ДНК для дослідження хлоропластів і мітохондрій соматичних гібридів має переваги – можливість виявлення перебудови ДНК, цілого геному. На відміну від ДНК пластид аналіз ДНК мітохондрій за соматичної гібридизації показує, що у вищих рослин можлива рекомбінація між геномами мітохондрій. 4 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

59 Лекція 7. Тема: Мутагенез та клітинна селекція. Зміст: 1. Процес одержання мутантних форм шляхом селекції на клітинному рівні; 2. Вихідні матеріали для клітинної селекції; 3. Мутагенез та відбір клітин за ознаками; 4. Науково-практичне значення робіт з клітинної селекції; 5. Кріозбереження рослинного матеріалу. Клітинна селекція – сукупність методів відбору клітинних ліній з новими успадкованими знаками в умовах ін вітро. Основні етапи одержання мутантних форм шляхом селекції на клітинному рівні: 1.Відбір обєкту для мутагенезу – калусні, суспензійні культури, ізольовані протопласти; 2.Обробка обєкту мутагеном (фізичні фактори – температура, опромінювання, хімічні речовини та ін.; 1 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

60 3.Інкубація клітин на рідкому поживному середовищі у неселективних умовах; 4.Перенесення суспензії у селективні умови (засолення, токсини, гербіциди, понижені або високі температури, метали та ін.); 5.Виділення життєздатних колоній, які вижили в жорстких селективних умовах; 6.Відбір змінених, стійких до селективного фактора клонів; 7.Індукція органогенезу або ембріоїдогенезу; 8.Одержання змінених рослин-регенерантів, які відрізняються в порівняні з материнськими рослинами; 9.Висадка рослин у грунт, вивчення генетичної природи стійкості, тестування на стійкість. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

61 Обєктом для мутагенезу і селекції можуть бути калусні, суспензійні культури або ізольовані Протопласти Калусна тканина – доступний матеріал, який відносно легко одержують у лабораторних умовах. Використовують свіжовиділену калусну тканину, що не втратила регенераційної здатності. Відбір мутантів за допомогою калусних тканин часто використовують при селекції ліній, (стійких до фітозахворювань) і стресових факторів (Левенко Б.О., 1991). Клітинна суспензія – це поодинокі клітини або клітинні агрегати, які вирощують на рідкому поживному середовищі в умовах постійної аерації. Аерація обєктів забезпечується такими способами: Культурою клітин, які занурені у рідке поживне середовище на качалках ротаційного або шейкерного типу (накопичувальне культивування); Вирощуванням шматків калусуна містках-підтримках з фільтрувального паперу. 2 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

62 Протопласти - голі клітини, які позбавлена оболонки і включає ядро і цитоплазму, в якій знаходяться органели. У великих однорідних популяціях гаплоїдних або диплоїдних протопластів проводять кількісні дослідження мутагенезу соматичних клітин, аналізують експресію індукованих фенотипових змін на клітинному і організменому рівні. Основними вимогами, що ставляться до модельних обєктів у клітинній селекції є: швидкий ріст у культурі ін вітро, збереження регенераційної здатності, невелика кількість хромосом, наявність високоефективної методики виділення і культивування протопластів, клітин, існування справжніх гаплоїдів, короткий життєвий цикл рослин (Сидоров В.А.,1990). Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

63 Раптові зміни спадкового матеріалу називають мутаціями. Клітини або організми, які є носіями змінених генів і відрізняються від вихідного (дикого) типу, називають мутантами. Мутації можуть стосуватись як ядерних генів, так і їх цитоплазматичних структур, що несуть у собі ДНК (мітохондрії, хлоропласти). Розрізняють такі типи мутацій: Генні, або точкові, мутації – спадкові зміни гена, які найчастіше відбуваються в одному з двох алельних локусів пари гомологічних хромосом. Мутантні гени є переважно рецесивними. Хромосомні мутації – одна або декілька хромосом виявляють структурні зміни, що викликано розривами та перебудовами хромосомного матеріалу. Геномні мутації обумовлені змінами числа хромосом в хромосомних наборах (геномах) або ж змінами кількості хромосомних наборів у мутованих клітинах. Геномні мутації, як правило, викликають явище поліплоїдії (кратне збільшення числа хромосом). Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

64 Плазмонні мутації виникають внаслідок можливих мутацій позахромосомних спадкових структур клітини, окрім локалізованих у пластидах. Пластидні мутації характеризуються змінами пластид хлорофільних зерен (білоплямистість, строкатолистість 3 Мутагенез – процес виникнення мутацій під впливом різних фізичних і хімічних мутагенних факторів. Серед хімічних супермутагенів ін вітро використовують два класи речовин: клас НАК (нітрозоалкілсечовин) і ДАК (діазокетонів). Найбільш поширені супермутагени: етилметансульфонат (ЕМС); диметилсульфонат (ДМС); метилметансульфонат (ММС); етиленмін (ЕМ) та ін. Фізичні: іонізуюче (рентгенівське, гама-промені) і ультрафіолетове випромінювання. Найбільш широкий спектр мутацій спостерігається при використанні іонізуючого випромінювання. При рентгенівському опроміненні клітин вченими одержані пігментдефектні лінії дурману і петунії, хлорстійкі лінії тютюну. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

65 Способи відбору необхідних фенотипових варіантів на клітинному рівні можна класифікувати так: Пряма (позитивна) селекція, при якій виживає лише певний мутантний тип клітин; Непряма (негативна) селекція. Ґрунтується на вибірковій загибелі клітин дикого типу та виживанні метаболічно неактивних клітин, які потребують додаткової ідентифікації у них мутаційних змін; Візуальна селекція та неселективний відбір, коли ідентифікація лінії серед всієї популяції клітин відбувається візуально або за допомогою біохімічних методів; Тотальна селекція, яка передбачає індивідуальне тестування всіх клітинних клонів. 4 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

66 Кріобіологія (від грецьк. kryos – холод, мороз, лід) – розділ біології, який вивчає дію на живі системи низьких та наднизьких температур (від 0 ºC до абсолютного нуля). Термін «кріозбереження» (анг. cryopreservation) застосовується для позначення складного багатоетапного процесу, метою якого є обмежено тривале зберігання життєздатних клітин, меристем або органів рослин в стані холодового анабіозу. Єдиним надійним засобом для вирішення цієї проблеми є глибокий холод (нижче - 140ºС), який забезпечує використання рідкого азоту (- 196 ºС) або його парів (- 150ºС) 5 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

67 Кріозбереження як система єдиного екстремального процесу (заморожування – зберігання – розморожування) складається з таких етапів: підготовка обєкту, додавання кріопротектора, заморожування в певному режимі, зберігання в рідкому азоті, розморожування, видалення кріопротекторів (відмивка), рекультивація (для клітин), регенерація цілих рослин. Кріопротектори – це речовини, які звязують вільну воду як в міжклітинниках, так і в клітинах; ускладнюють її кристалізацію за рахунок утворення з нею водневих звязків; зменшують ущільнення протопластів клітин при заморожуванні. Використовують різноманітні речовини - кріопротектори : диметилсульфоксид (ДМСО), поліетиленгліколь(ПЕГ), поліетиленоксид, етеленгліколь, гліцерин, сахарозу, сорбіт, маніт, лактозу та ін. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

68 Генна інженерія – це система штучного конструювання рекомбінантних (гібридних) ДНК і введення їх в живий організм з метою одержання спадкових змін. Тобто, це цілеспрямоване переміщення окремих генів з одного генетичного оточення в інше. У результаті спадкова інформація організму змінюється, йому надаються нові генетичні і, відповідно, біохімічні та фізіологічні властивості, корисні для людини. Одержаний в результаті таких маніпуляцій організм позначається як трансгенний Лекція 8. Тема: Генна інженерія рослин. Зміст: 1.Історія становлення та сутність генної інженерії; 2.Інструменти генної інженерії та їх використання; 3.Методи переносу чужорідних генів в рослини; 4.Проблеми, досягнення і перспективи генної інженерії. 1 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

69 Історія становлення: 60-і - початок 70-х років, коли Дж.Беквіс з колегами виділили "чистий" ген - галактозидази Е.соli, а в лабораторії Г.Корани був синтезований хімічним шляхом ген аланінової т-РНК дріжджів. У дослідників з'явилась можливість маніпуляції з генами (введення їх або замша на інші). Народженням генної інженерії як самостійної дисципліни можна вважати грудень 1972 р., коли Поль Берг із співробітниками (США, Стендфорський університет) сповістили про створення першої рекомбінантної молекули ДНК. У 1974 році було накладено добровільний мораторій на деякі види досліджень з генної інженерії, проте у 1975 році на міжнародній Асилморській конференції у США мораторій було відмінено, бо очікувані прибутки від генної інженерії перевищують можливу шкоду Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

70 Гени одержують одним із трьох способів: 1.Безпосереднім виділенням з природного матеріалу, 2.Шляхом хімічного синтезу 3.Копіюванням інформаційних РНК для одержання комплементарних ДНК (ензиматичний метод). Ген, тобто певну ділянку ДНК, "впізнають" і "вирізають" з цілої молекули ДНК за допомогою спеціальних рестрикційних ендонуклеаз (рестриктаз) Процес з'єднання в єдину структуру фрагментів, що розрізані рестриктазами, здійснюють інші ферменти – лігази. Також використовують вектори - плазміди або віруси (бактеріофаги), які здатні переносити в клітину вмонтований в їх ДНК чужий ген, забезпечуючи там його реплікацію та синтез білкових продуктів. Вектор - це молекулярний прилад для доставки чужорідних генів у різні організми; фактично - це "віз" для генів. 2 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

71 Більшість експериментів з генетичної інженерії проводяться на ДНК плазмід бактерій. Плазміди - це невеликі кільцеві молекули ДНК, які присутні у більшості бактерій разом із хромосомною ДНК. Вони здатні до автономної реплікації, тобто несуть гени, що відтворюють власну ДНК 3 Першу групу експериментальних підходів складають методи введення генів за допомогою природних векторів ( на основі Ті-плазмід Agrobacterium tumifaciens, Rі-плазмід А.rhizogenes, транспозованих елементів, вірусів і віроїдів) Другу - прямі методи введення чужорідної ДНК в геном вищих рослин (пряма трансформація протопластів, мікроінєкції, електропорація, упакування в ліпосоми, біолістика та ін.)(Пизурян Е.С., 1986; Пастернак Т.П., 1991). Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

72 Масштаб досягнень в генній інженерії рослин на сьогодні: Для поліпшення смакових властивостей рослинної продукції (надання солодшого смаку) використовують гени синтезу монеліну або тауматину – білків, які в разів солодші, ніж цукор. Ген синтезу монеліну введено в рослини томатів і цибулі-латуку. Трансгенні рослини накопичують цей білок у значній кількості в плодах і листках. Отримані трансгенні рослини сої і кукурудзи з поліпшеними якостями жирів, з дуже низьким вмістом поліненасичених жирних кислот Клоновано гени запасних білків сої, гороху, квасолі, кукурудзи, картоплі та багато ін. Створенню трансгенні рослини конюшини, що містять ген синтезу білка соняшнику з підвищеним вмістом сірковмісних амінокислот. Отримано насіння трансгенних кормових культур, які містять набір ферментів для підвищення засвоєння кормів, антибіотики, вітаміни та ін корисні складові. 4 Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

73 Методами генної інженерії змінюють вміст і склад вуглеводів в бульбах картоплі, томатів, цукрових буряків Істотним недоліком плодів протягом зберігання є їх розмякшення після дозрівання, яке обумовлюється ферментом полігалактуроназою. Для усунення цього недоліку перспективним виявився генно-інженерний метод з синтезом цього ферменту, який у трансгенних томатів визиває лежкість, тобто можливість тривалішого зберігання без гниття. У трансгенних рослин томатів і петунії значно зріс термін дозрівання плодів, а також термін цвітіння і обпадання квіток. Використання цього методу може призвести до суттєвих змін у декоративному садівництві: відкриваються можливості значно довше зберігати зрізані квіти без зміни їхніх властивостей. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.

74 Отримані трансгенні рослини цвітної капусти, що характеризуються затримкою старіння. Серед генів, що визначають стійкість проти гербіцидів, клоновані гени стійкості таких гербіцидів, як Раундап (гліфосат), Баста та ін. Із використанням цих генів отримано трансгенні рослини кукурудзи, сої, бавовнику, картоплі, цукрових буряків, гречки, тютюну та ін. Вивчена можливість отримання трансгенних рослин картоплі, рису, сої, квасолі, пшениці, ячменю, які стійкі проти шкідників за рахунок введення генів рослин з інсектицидною активністю Зі зміненою пігментацією квіток отримані рослини гербери, хризантеми, троянди, гвоздики та ін. Аналогічні підходи використовують для створення квіток зі зміненим забарвленням, а також для зміни пігментації плодів і деревини. Основи біотехнології рослин 3 курс Спеціальність: Агрономія Викладач: Прокопчук В.М.