Центр коллективного пользования «Биология живой клетки и биомедицинские нанотранспортеры лекарств» Институт биологии гена РАН 119334, Москва, ул. Вавилова, - презентация

1 Центр коллективного пользования «Биология живой клетки и биомедицинские нанотранспортеры лекарств» Институт биологии гена РАН , Москва, ул. Вавилова, д. 34/5, Численность сотрудников ЦКП 9 человек

2 Основные направления исследований ЦКП: Регуляция работы гена и структура хроматина, функциональная геномика и биоинформатика. Молекулярная медицина, генотерапия, стволовые клетки, клеточная терапия, биотерапия опухолей. Структура и функционирование клетки, межклеточные взаимодействия, молекулярные основы клеточной дифференцировки, иммунитета и онкогенеза. Генная и белковая инженерия, трансгеноз Проведение комплекса нанобиомедицинских исследований

3 Приборная база и перечень услуг, оказываемых ЦКП ИБГ РАН Прибор для исследований методом поверхностно- плазмонного резонанса Biacore X * Расчет кинетических констант взаимодействий молекул. * Определение концентрации веществ в сильно разбавленных растворах * «Вылавливание» («fishing») веществ для дальнейшего анализа. Спектрофотометр NanoDrop ND Спектрофотометр позволяет проводить измерение до 8 образцов одновременно. * Определение концентрации и чистоты нуклеиновых кислот. * Количественный анализ протеинов, коньюгатов, метало- протеинов. * Анализ белков методами Бредфорд, Лоури. * Измерение плотности клеток в суспензии. * Определение интенсивности флюоресценции при связывании метки с нуклеиновыми кислотами в биочипах.

4 Атомно-силовой микроскоп с контроллером Nanoscope III A * Определение топографии поверхности образца с атомным разрешением ~1 Ǻ по оси z и ~1 нм в плоскости xy (зависит от используемого зонда). Максимальная область сканирования 150×150 мкм в плоскости xy и 6 мкм по оси z. Изучаемая поверхность может контактировать как с воздухом, так и с жидкой фазой. * Определение силы взаимодействия между зондом и образцом. При этом, возможна модификация зонда специфическими биомолекулами (например, антителами). Минимальная достоверно измеряемая сила взаимодействия 30 пН.

5 Оборудование для трансфекции Nucleofector. Осуществление высокоэффективной доставки генетического материала в большое число различных по происхождению клеток: * Получение стабильных клеточных линий- продуцентов целевых белков на основе линий клеток CHO-K1, SF+, Pichia methanolica. * Изучение активностей регуляторных элементов генома в клеточных линиях человека, мыши, курицы, дрозофилы. * Выключение экспрессии целевого гена при помощи siRNA. * Модифицирование первичных культур клеток человека, мыши для направленного изменения свойств клеток.

6 Проточный цитометр сортер Epics Altra * Определение жизнеспособности клеток, содержания ДНК в клетке, определение фагоцитарной активности, определение внутриклеточных цитокинов. * Анализ уровня экспрессии репортерных генов в клетках. * Сортировка клеток по любым определяемым параметрам. ZetaPALS * Определение с помощью метода динамического светорассеяния гидродинамического радиуса наночастиц в пределах от 0,6 нм до 6 мкм;. * Определение дзета-потенциала наночастиц в пределах 6 мкВ до 100 мВ при рН от 1 до 13, при температуре от 6 °С до 100 °С и при электропроводности от 0 до 20 Си/м. Типичная длительность измерения – 30 с.

7 Приборы ПЦР в реальном времени CFX-96 (BioRad) и StepOne Plus (Applied Biosystems) * Генотипирование организмов, идентификации аллелей (вариантов) генов. * Геномная дактилоскопия (идентификация индивидуальных организмов, в частности для целей судмедэкспертизы). * Обратная транскрипция (конвертация РНК в ДНК). * Идентификация ДНК возбудителей заболеваний бактериальной и вирусной, паразитарной природы в пробе. * Генотипирование вариантов генов (в частности анализ антибиотикоустойчивости микроорганизмов, анализ предрасположенности к заболеваниям). * Анализ хромосомных нарушений (в частности при онкогенезе, в пренатальной диагностике, и др.). * Анализ экспрессии генов. * Установление титра возбудителей в пробе (количественная диагностика вирусов и др. инфекционных агентов в пробе). * Определение генно-модифицированных организмов и содержания ГМО в пробах. * Оптимизация условий проведения ПЦР для праймеров клиента. * Анализ и обнаружение наличия мутаций (в т.ч. SNP).

8 Мультифотонный микроскоп LSM 510 META NLO * Анализ распределения и интенсивности флуоресценции в фокальной плоскости и по объему в биологических образцах (клетках и тканях) в диапазонах длин волн: в конфокальном режиме – от 458 нм до 633 нм; в мультифотонном режиме – в соответствии с диапазоном ИК-лазера (710 – 990 нм); * Определение характеристических времен затухания флуоресценции в изучаемом образце; * Анализ изображений в режиме FLIM (fluorescence lifetime image microscopy - флуоресцентная микроскопия в реальном времени, дающая возможность определять характеристики затухания флуоресценции); * Анализ методом FRAP; * Определение колокализации флуоресцентных молекул как по наложению «красок», так и по данным FRET (флуоресцентного резонансного переноса энергии).

9 Фосфоимиджер Cyclone Storage Phosphor Screen Определение распределения радиоактивного зонда в образцах, пришитых к найлоновым и нитроцеллюлозным мембранам: 1. Анализ полиморфных локусов в геноме 2. Количественное определение повторяющихся участков генома 3. Анализ уровня экспрессии генов 4. Характеристика длины и структуры транскриптов 5. Определение участков связывания для ДНК- и РНК-связывающих белков. Конфокальный микроскоп Leica TCS SP2 * Измерение распределения интенсивности флуоресценции в фокальной плоскости и по объему исследуемых образцов при разных длинах волн в диапазоне длин волн возбуждения флуоресценции 450 – 663 нм (до семи независимых каналов регистрации одновременно). * Получение трехмерных изображений флуоресцентно меченных препаратов с измерением геометрических параметров. * Математическая обработка изображений. * Анализ процессов методами FRET и FRAP * Определение колокализации флуорофоров в образце.

10 Прибор рассчитан на использование различных микропланшетов ( луночные планшеты различных производителей). Прибор оборудован двумя поршневыми диспенсерами для внесения реагентов (объем впрыска мкл), системами для термостатирования (4°C - 50°C ± 0.5°C) и встряхивания микропланшета. Универсальный микропланшетный ридер Synergy 4. Модульная изменяемая архитектура ридера позволяет определять: * интенсивность флюоресценции; * флюоресценцию с временным разрешением; * поляризацию флюоресценции; * быстро (flash-) и медленно (glow-) протекающую люминесценцию; * поглощение в УФ и видимой области спектра; * FRET (исследование резонансного переноса энергии флюоресценции); * TR-FRET (исследование резонансного переноса энергии флюоресценции с временным разрешением); * BRET (исследование резонансного переноса энергии биолюминесценции); * спектральное сканирование.

11 Наиболее значимые результаты, полученные с использованием научного оборудования ЦКП: Спроектированы и синтезированы 6 простых модулей искусственных регуляторных элементов (СИ-элементы) и тест-системы для их тестирования; проведено генно- инженерное клонирование разработанных конструкций в культурах клеток млекопитающих; испытана эффективность использования СИ-элементов в трансгенных мышах; проведена поисковая работа по выяснению механизмов функционирования инсуляторов, защищающих трансген от действия окружающих негативных и позитивных регуляторных элементов. Создан новый модульный рекомбинантный транспортер DTox-HMP-СЯЛ-ЭФР для доставки лекарственных агентов в опухолевые клетки с повышенной экспрессией рецепторов erbB1, что к настоящему времени выявлено в опухолях человека, имеющих различное происхождения (карциномы различной локализации, глиомы и многие другие). В исследованиях по разработке генодиагностики и генотерапии рака определена экспрессия 15 антигенов, принадлежащих к различным семействам и 3 - дифференцировочных антигенов меланомы, проанализирован белок HLA-Е, выделенный из лизатов клеток меланомы: показана экспрессия мРНК и локализация данного белка; в процессе исследований разработана методика выделения клеток меланомы кожи из тканевых образцов, проведена первичная характеристика опухолевых клеток и анализ антигенной специфичности выделенных опухолевых клеток.

12 Наиболее значимые результаты, полученные с использованием научного оборудования ЦКП: Приведено научное обоснование создания средств блокирования биологической функций ФРЭС (фактор роста эндотелия сосудов) с целью контроля за патологическим неоангиогенезом при нарушениях зрения, аутоиммунных заболеваниях и злокачественных опухолях; показано, что стратегия блокирования функций ФРЭС с помощью антител является наиболее перспективной; получены наноантитела к ФРЕС; изучена специфическая активность субстанции наноантител к ФРЭС на модельных животных in vivo. Разработаны модельные тест-системы in vitro для определения влияния компонентов сырья растительного на пролиферацию опухолевых клеток в культуре. Разработаны модельные тест-системы in vitro для определения влияния компонентов жирных кислот гидробионтов (ЖКГ) на пролиферацию опухолевых клеток в культуре. Показана возможность использования семейства генов tag7-tagL в целях разработки новых подходов к терапии рака.

13 Наиболее значимые результаты, полученные с использованием научного оборудования ЦКП: Создана линия клеток, содержащая сайт для интеграции экспериментальных генетических конструкций в геном, обладающая свойством регулируемой экспрессии репортерного гена в строго воспроизводимом участке генома. Составлена лабораторная пропись тест-системы для определения степени предрасположенности индивидуума к формированию злокачественных опухолей; составлена лабораторная пропись тест-системы для определения чувствительности злокачественных опухолей к химиотерапевтическим агентам, включая препараты Эрбитукс, Иресса, Тарцева; составлена лабораторная пропись тест-системы для определения степени клональности лимфом; составлена лабораторная пропись тест- системы для определения стратегии лечения генно-клеточными вакцинами. Созданы два стимулирующих изолятора, которые позволяют увеличить наработку целевых белков в культуре клеток млекопитающих для достижения высокого и стабильного уровня наработки целевых белков в культурах клеток и тканях млекопитающих Все научные результаты являются уникальными и востребованными.