Белорусский государственный университет Биологический факультет Кафедра биохимии Анализ гепатопротекторных свойств синтетических аналогов простагландинов. - презентация

1 Белорусский государственный университет Биологический факультет Кафедра биохимии Анализ гепатопротекторных свойств синтетических аналогов простагландинов группы Н на клеточной модели повреждения печени четыреххлористым углеродом Магистерская диссертация Петровой Светланы Михайловны Научный руководитель к.б.н., доцент Шолух Михаил Васильевич Минск 2010

2 Содержание: Актуальность исследования Цель и задачи Объект исследования Материалы и методы Результаты Список опубликованных работ Выводы

3 Поддержание цереброваскулярного тонуса Ингибирование секреции кислоты в желудке приматов Повышение термостабильность и эукариотических клеток Антиаритмическое, гипотензивное, антиагрегационное действие Актуальность исследования:

4 Цель и задачи: Цель настоящей работы: Исследование гепатопротекторных свойств синтетических аналогов простагландинов группы Н на клеточной модели повреждения печени четыреххлористым углеродом и механизмов их реализации. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи: 1. Оценить гепатопротекторные свойства 12 синтетических простаноидов группы Н на клеточной модели повреждения печени 0,5 % CCl 4 in vitro. Оценку провести по параметрам: выход ЛДГ, ГДГ, КФ, SH-группы, триеновые конъюгаты; 2. Исследовать механизм гепатопротекторного действия синтетических аналогов ПГН путем ограничения свободнорадикальных процессов в мембранах гепатоцитов после их обработки 0,5 % CCl 4 ; 3. Исследовать максимальный цитопротекторный эффект простаноидов, при условии что аналоги внося в суспензию гепатоцитов за 15 минут до 0,5 % CCl 4.

5 Объект исследования: Синтетические аналоги простагландинов группы Н, синтезированные и любезно предоставленные для исследования сотрудниками лаборатории химии простагландинов ИБОХ НАН Беларуси.

6 Материалы и методы: В работе были использованы следующие материалы и реактивы: АДФ динатриевая соль, Hepes, Трис, малатдегидрогеназа, р- нитрофенилфосфата натриевая соль, среда для культивирования клеток ДМЕМ, Тритон Х-100, ЭДТА ("Sigma", США), БСА(ДиаМ, Австралия), простагландин I 2 (Cayman Chemical Co., Великобритания), четыреххлористый углерод, лактатдегидрогеназа, никотинамидадениндинуклеотид восстановленный ("Reanal", Венгрия). Остальные реактивы, использовавшиеся в работе, имели квалификацию "ЧДА", "ХЧ" или "ОСЧ". Во время выполнения работы были использованы следующие методы: физико-химические методы выделения гепатоцитов из печени крыс, спектрофотометрические методы анализа активности ферментов и продуктов перекисного окисления липидов. флюориметрические методы определения внутриклеточного содержания ионов Са 2+. статистические и вычислительные методы анализа. электрофоретические.

7

8 Модель повреждения печени ССl 4 изменение состава и секреции липопротеинов нарушение метаболизма липидов ПОЛ свободные радикалы ингибирование синтеза липидов de novo изменение вязкости мембран CCl 4 ССl 4 +ПГ ?

9 Рис.1. Зависимость степени спонтанной гибели гепатоцитов в первичной суспензии от времени их инкубации (n=3). Результаты:

10 Основные маркеры клеточного повреждения гепатоцитов 0,5% ССl 4 (n=5) Измеряемый параметр Контроль х±Sx +0,5% ССl 4 х±Sx ЛДГ, % цитотоксичности 0,0066,0±2,6 ГДГ, % цитотоксичности 0,0057,5±0,7 КФ, % цитотоксичности 0,0047,7±1,2 Уровень SH-групп, мкмоль/ млн.клеток 3,0±0,52,8±0,6 Содержание триеновых конъюгатов, ед. опт. плотн. 0,010,31±0,1 CCl 4

11 Рис. 2. Действие природного ПГI 2 и простаноидов серии Н на индуцированное ССl 4 высвобождение ЛДГ из гепатоцитов. Примечание – За 100% принят эффект 0,5% ССl 4.

12 LP-167 (-58%) > LP-165 (-56%) > LP-67 (-37%) > ПГI 2 (-36%) > LP-84 (-35,8%) > LP-172 (-29%) > LP-22 (-23%) > LP-147 (-21%) > LP-41 (-9%) > LP-175 (-7%) > LP-120 (-5%) > LP-171 (-3%) > LP-25(0 %)

13 Рис.3. Влияние аналогов ПГН на уровень SH-групп и уровень триеновых конъюгатов в мембранах гепатоцитов, обработанных 0,5% ССl 4. Примечание I–Простаноиды использовали в максимально эффективных концентрациях (LP-167 – моль/л; LP-165, LP- 172 – 10-9 моль/л; LP-22, LP моль/л; LP-67, ПГI 2 – 10-7 моль/л). Примечание II -* - различия достоверны при р 0,05 (n=3).

14 Рис.4. Влияние ССl 4 и аналогов ПГН на уровень ионов кальция в цитоплазме гепатоцитов крыс. ССl 4 ЭГТА SDS

15 СНИЖЕНИЕ ЦИТОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТИ N O CO 2 CH 3 O N LP-22

16 ВЫВОДЫ: 1. Действие 0,5% ССl 4 на первичную клеточную суспензию гепатоцитов печени крыс in vitro характеризуется поражением их плазматических и внутриклеточных мембран. Коэффициент цитотоксичности оцененный по выходу маркерных ферментов из внутриклеточных компартиментов составляет 86,0±2,6 для ЛДГ; 67,5±0,68 для ГДГ; 7,7±1,2 для КФ. Действие 0,5% ССl 4 сопровождается накоплением триеновых конъюгатов в мембранах клеток и снижением внутриклеточного уровня SH-групп. 2. Анализ цитопротекторных свойств 12 аналогов ПГH и природного ПГI 2, взятых в концентрациях моль/л, показал наличие выраженных защитных эффектов ПГI 2 (10-7 моль/л) и аналогов LP- 172, LP-165, LP-167, LP-84, LP-67, LP-22, снижавших в концентрациях моль/л утечку внутриклеточных ферментов, после обработки клеток 0,5% ССl 4 на 39,1-75,7%. 3. Показана возможность реализации гепатопротекторного эффекта аналогов ПГН через снижение интенсивности ПОЛ в клеточных мембранах для аналогов LP-67, LP-65, LP-22 и коррекцию Са- гомеостаза для аналогов LP-84, LP-167, LP Максимальный защитный эффект наблюдался у аналога LP-167, характеризующегося наличием титульного фрагмента в 16-ом положении ω-цепи. Замена титульного фрагмента на неоновый заместитель, атом азота, а также гидроксильную группу, нитритную группу, атомы хлора и серы в структуре замещенной ω-цепи ПГ приводит к снижению и полной потере цитопротекторных свойств аналогов ПГН.

17 Список опубликованных работ: Статьи в журналах: 1. Губич О.И., Петрова С.М., Грицук О.Е., Шолух М.В. Исследование цитопротекторного действия 9,11- // Новости мед.-биол. наук. – – с Губич О.И., Петрова С.М., Шолух М.В. Эффективность защиты гепатоцитов 9,11- этаноаналогов простагландинов группы Н от токсического действия хлороформа // Труды Бел. гос. ун-та. – Серия физиолог., биохим. и молекулярные. основы функционирования биосистем. – – т.4, ч. 1 – с Материалы конференции: 1. Петрова С. М. Исследование цитопротекторных свойств синтетических аналогов простагландинов группы Н // Сборник материал. Междунар. форума студенческой и учащейся молодежи «Первый шаг в науку » - М.: «Право и экономика». – т.II. – с Hubich A.I. Petrova S.M. The investigation of hepatoprotective action of 9,11-ethanoprostaglandin H analogs in vitro // Materials of IV International Young Scientists Conf. Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution. – Odesa, Sept – p Диплом победителя международного форума студенческой и учащейся молодежи «Первый шаг в науку », секция «Современные биотехнологии».

18 Спасибо за внимание !