Влияние РНК-интерференции на экспрессию гена AML1-ETO экспрессию Д. В. Посредник научный руководитель В. В. Гринев Белорусский государственный университет. - презентация

1 Влияние РНК-интерференции на экспрессию гена AML1-ETO экспрессию Д. В. Посредник научный руководитель В. В. Гринев Белорусский государственный университет кафедра генетики кафедра генетики

2 Цель: оценка эффективности подавления экспрессии гибридного гена aml1-eto с помощью РНК-интерференции в клетках ОМЛ линий Kasumi-1 и SKNO-1.

3 Задачи: Оценить эффективность подавления экспрессии гибридного гена aml1-eto в клетках ОМЛ линий Kasumi-1 и SKNO-1 с помощью РНК-интерференции, запускаемой кшРНК. Оценить эффективность подавления экспрессии гибридного гена aml1-eto в клетках ОМЛ линий Kasumi-1 и SKNO-1 с помощью РНК-интерференции, запускаемой кшРНК. Синтезировать и клонировать последовательность, кодирующую искусственные анти-AML1-ETO микроРНК. Синтезировать и клонировать последовательность, кодирующую искусственные анти-AML1-ETO микроРНК. Разработать челночный плазмидный вектор pDsRed1/amiAML1-ETO, кодирующий искусственные анти-AML1-ETO микроРНК, и изучить его функциональную активность. Разработать челночный плазмидный вектор pDsRed1/amiAML1-ETO, кодирующий искусственные анти-AML1-ETO микроРНК, и изучить его функциональную активность. Оценить эффективность подавления экспрессии гибридного гена aml1-eto в клетках ОМЛ линий Kasumi-1 и SKNO-1 с помощью РНК-интерференции, запускаемой искусственными анти-AML1-ETO микроРНК. Оценить эффективность подавления экспрессии гибридного гена aml1-eto в клетках ОМЛ линий Kasumi-1 и SKNO-1 с помощью РНК-интерференции, запускаемой искусственными анти-AML1-ETO микроРНК.

4 Основные понятия: РНК-интерференция это механизм подавления экспрессии гена, то есть проявления данного гена в организме в форме определенного признака на стадии трансляции. РНК-интерференция это механизм подавления экспрессии гена, то есть проявления данного гена в организме в форме определенного признака на стадии трансляции. МикроРНК класс некодирующих РНК, которые имеют длину около 22 нуклеотидов. Эти РНК играют важную роль в регуляции трансляции и деградации мРНК. МикроРНК класс некодирующих РНК, которые имеют длину около 22 нуклеотидов. Эти РНК играют важную роль в регуляции трансляции и деградации мРНК. кшРНК – то же, что и микроРНК, но внеклеточного происхождения, то есть, не кодируются геномом клетки и не проходят процессинг в ядре. кшРНК – то же, что и микроРНК, но внеклеточного происхождения, то есть, не кодируются геномом клетки и не проходят процессинг в ядре.

5 wt 5LTR RRE cPPt P SFFV eGFP WPRE SIN 3LTR P H1 смысловая петля антисмыловая терминатор нить нить wt 5LTR RRE cPPt P SFFV eGFP WPRE SIN 3LTR Схема строения лентивирусных векторов доставки pHRSINcPPT-SEW (А) и pHR-shAML1/ETO (Б). А) Б)

6 Эффективность трансдукции клеток линий Kasumi-1 (А) и SKNO-1 (Б) VSV-G псевдотипированным лентивирусом, основанным на векторе рHR-shAML1/ETO. Б) 99.94% ( ) 98.21% ( ) А) Флуоресценция

7 Искусственное подавление белка AML1-ETO с помощью anti-AML1-ETO коротких интерферирующих РНК в клетках острого миелоидного лейкоза линий Kasumi-1 (А) и SKNO-1 (Б). AML1-ETO GAPDH Контроль pHRSINcPPT-SEW pHR-shAML1/ETO A AML1-ETO GAPDH Контроль pHRSINcPPT-SEW pHR-shAML1/ETO Б

8 F_AML1-ETO BamH I перекрывающаяся область 5- ATGGATCCAGTGAGCGCACCTCGAAATCGAATACTGAGAAGGGTGAAGCCACAGATG - 3 R_AML1-ETO SalI перекрывающаяся область 5'- GTCGTCGACAGTAGGCAAACCTCGAAATCGTACTGAGAAGACATCTGTGGCTTCACCCT -3' Б) а) Сиквенс олигонуклеотидов и их вторичная структура, рассчитанная с помощью программного пакета Mfold 3.2 ([Na + ] = 60 mM, [Mg 2+ ] = 1.5 mM и +37 o C).

9 Карта челночного плазмидного вектора pDsRed1-С1.

10 А) Б) Вторичные структуры DsRed1 mRNA (А) и DsRed1/AML1- ETO mRNA (Б), рассчитанные с помощью программного пакета Mfold pre-mir- 30a/AML1-ETO Б)

11 pEGFP-C1 pDsRed1-C1 pDsRed1/amiAML1-ETO Тип челночного плазмидного вектора Положительные по репортерному белку клетки, % Результаты котрансфекции челночными плазмидными векторами pDsRed1-C1, pDsRed1/amiAML1-ETO и pEGFP-C1 клеток линии 293Т НЕК

12 A) Б)Б) СветЗеленая флуоресценцияКрасная флуоресценция В)В)

13

14 A) Б)Б) wt 5LTR RRE cPPt P CMV DsRed1 IRES eGFP WPRE SIN 3LTR wt 5LTR RRE cPPt P CMV IRES eGFP WPRE DsRed1/amiAML1-ETO SIN 3LTR Схема строения лентивирусных векторов доставки pHR-CMV-DRep (A) и pHR-CMV-DRep/amiAML1-ETO (Б)

15 Эффективность трансдукции клеток линий Kasumi-1 и SKNO-1 DRep/Control/v.01 и pHR-DRep/amiAML1-ETO/v.01 VSV-G-псевдотипированными лентивирусами.

16 Стабильность наследования лентивирусных векторов DRep/Control/v.01 и pHR-DRep/amiAML1-ETO/v.01 в клетках линий Kasumi-1 и SKNO-1, интегрировавшихся в геном.

17 AML1-ETO GAPDH Mock DRep/Control/v.01, нативный pHR-DRep/amiAML1-ETO/v.01, нативынй DRep/Control/v кратно сконцентрированный pHR-DRep/amiAML1-ETO/v кратно сконцентрированный DRep/Control/v.01, суперинфекция pHR-DRep/amiAML1-ETO/v.01, суперинфекция

18 Выводы были озвучены по ходу доклада.

19 автор благодарен С.В. Глушену за помощь в проведении микроскопических исследований И.Н. Северину за помощь в проведении цитометрических исследований D. Trono за предоставленные вектора pCMV_dR8.91 и pMD2.G M. Scherr за базовый лентивирусный вектор доставки pHR-SINcPPT-SIEW O. Heidenreich за векторы pHRSINcPPT-SEW и pHR- shAML1/ETO сотрудникам лаборатории клеточной и молекулярной биологии лейкозов за помощь в проведениях исследований

20 Спасибо за внимание. вернуться к началу презентации