СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ. Серологические реакции – это реакции между антигенами и антителами in vitro. Цели применения: серодиагностика бактериальных и. - презентация

1 СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

2 Серологические реакции – это реакции между антигенами и антителами in vitro. Цели применения: серодиагностика бактериальных и вирусных инфекционных заболеваний; сероидентификация выделенных культур различных микроорганизмов (определение родовой, видовой и типовой принадлежности микроорганизма или его антигенов с известными иммунными сыворотками); идентификация видовой принадлежности белков (выявление фальсификации мясных и рыбных изделий).

3 Классификация серологических реакций в зависимости от характера и физического состояния антигена -Прямые серологические реакции, основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (агглютинация, преципитация). -Опосредованные реакции – реакции со свидетелями (реакция непрямой гемагглютинации, реакция связывания комплемента). -Реакции с использованием меток (ферментных, флюоресцирующих и т.д.) для антигена или антитела (иммуноферментный анализ, реакция иммунофлуоресценции, радиоиммунный анализ).

4 Титр сыворотки – это наиболее высокое разведение сыворотки (наименьшее количество антител), при котором данная серологическая реакция будет положительной. Специфичность серологической реакции – способность антигена реагировать только с гомологичным антителом. Чувствительность серологической реакции - минимальное количество антигенов или антител, которое можно выявить с помощью данной реакции.

5 Серологические реакции 1. Реакция агглютинации 2. Реакция преципитации 3. Реакции нейтрализации 4. Реакция связывания комплемента 5. Реакция иммунофлуоресценции 6. Радиоиммунологический анализ 7. Иммуноферментный метод (ИФА)

6 Реакция агглютинации Реакция агглютинации (agglutinacio - склеивание) - склеивание и выпадение в осадок корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а также латексных частиц с адсорбированными на них антигенами под влиянием антител в среде с электролитом.

7 Реакция непрямой гемагглютинации РНГА применяют в двух вариантах: с известными антигеном для обнаружения антител или с известными антителами для выявления антигена. Для постановки РНГА используют эритроцитарные диагностикумы, приготовленные путем адсорбции на эритроцитах антигенов или антител в зависимости от цели исследования.

8 В положительных случаях в лунке осадок имеет вид тонкой пленки из склеивающихся эритроцитов (зонтик).

9 Реакция преципитации Принцип : При взаимодействии растворимого антигена с антителом в присутствии электролитов (NaCl) образуется комплекс Аг-Ат в виде нерастворимого преципитата. РП применяют в двух целях: выявление антигенов с помощью известной иммунной преципитирующей сыворотки или антител с использованием известных антигенов. Используется как качественный, так и количественный анализ (реакция Манчини). Очень чувствительная реакция для определения антигенов. С помощью РП определяют фальсификацию рыбных и мясных изделий.

10 Варианты реакции преципитации в жидкой среде - по типу реакции флокуляции, кольцепреципитации. в плотной среде (в агаре, полиакриламидном геле) - реакция преципитации по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия по Манчини, реакция иммуноэлектрофореза.

11 Реакция кольцепреципитации Образование комплекса АГ-АТ - + Реакцию проводят путем наслаивания на иммунную сыворотку антигена

12 Реакция проводится в агаре на стеклах или в чашках Петри. В разные лунки в агаре вносится взвесь, содержащая антиген и иммунная сыворотка. Из лунок антиген и антитела диффундируют в питательную среду, вступают в иммунную реакцию и образуют полосы преципитации. Реакция преципитации в геле по Оухтерлони

13 Полосы преципитации между антигенами в лунках G, E и иммунной сывороткой (антителами) в лунке A.

14 Иммуноэлектрофорез ИЭФ чаще всего используется для исследования антигенной структуры микроорганизмов. Принцип и последовательность проведения реакции 1. Антигенный комплекс помещают в лунку, которая находится в центре геля, залитого на стеклянную пластинку. 2. Через гель пропускают электрический ток, в результате происходит перемещение антигенов на неодинаковые расстояния соответственно своей электрофоретической подвижности. 3. В канавку вносят специфическую иммунную сыворотку. 4. Антигены и антитела диффундируют в геле навстречу друг другу. В месте их соприкосновения образуются линии преципитации.

15

16 Иммуноэлектрофорез Лунки, содержащие смесь антигенов Перемещение антигенов Диффузия антител из канавки и образование полос преципитации

17

18 IgG IgM Серологические реакции, основанные на использовании меток МЕТКИ Ферментные Флюоресцирующие радиоизотопные

19 Иммуноферментный анализ (ИФА или ΕLISA) Метод ИФА или ELISA – это серологическая реакция, в которой для визуализации образовавшегося комплекса антиген-антитело используются ферменты-метки (пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза). Эти маркерные (индикаторные) ферменты способны расщеплять субстрат и вызывать изменение цвета среды.

20 ИФА сэндвич-метод ИФА Обнаружение антител Обнаружение антигена

21 ИФА Пример: обнаружение антител к ВИЧ

22 Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) РИФ основана на соединении антигенов бактерий и вирусов со специфическими антителами, меченными флюоресцирующими красителями. Образовавшиеся комплексы АГ- АТ становятся хорошо видимыми под люминесцентным микроскопом. Преимущества РИФ: простота, высокая чувствительность, скорость получения результата.

23

24 Прямой метод РИФ - непосредственное соединение антигена с меченым флуоресцентным красителем антителом. Непрямой метод (РНИФ) – 1) образование комплекса антиген- антитело, 2) выявлении этого комплекса путем обработки его меченым флуоресцентным красителем антигаммаглобулиновом (АТ к АТ). Непрямой метод Прямой метод

25 Люминесцентный микроскоп

26 Реакция связывания комплемента РСК основывается на способности комплемента связываться с комплексом АГ + АТ. Реакция протекает в две фазы. Первая фаза ­- взаимодействие антигена и антитела. К исследуемой сыворотке, содержащей антитела, добавляют известный антиген и стандартный комплемент, инкубируют при 37 ° С в течение одного часа. Вторая фаза - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка кролика, содержащая гемолитические антитела к эритроцитам барана). К смеси антиген + антитело + комплемент добавляют индикаторную систему и вновь инкубируют при 37° С в течение мин. Если комплемент адсорбировался ранее на комплексе АГ + АТ (в исследуемой сыворотке специфические антитела присутствовали), то гемолиза эритроцитов не происходит. При отсутствии же в исследуемой сыворотке специфических антител, комплекс АГ + АТ не образуется и комплемент остается несвязанным. При добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней и происходит гемолиз эритроцитов.

27 Свойства комплемента Эритроциты + гемолитические антитела Комплемент Лизис эритроцитов Реакция гемолиза. В присутствии комплемента под действием гемолитических антител взвесь эритроцитов превращается в «лаковую кровь» вследствие выхода гемоглобина. Реакция гемолиза используется в РСК как индикаторная: для тестирования присутствия или отсутствия свободного комплемента.

28 РСК