«Астана медицина уничерситеті» А Қ жалпы иммунология кафедрасы Моноклонды антиденелер. Астана-2017 Қ абылда ғ ан: Даулетхан Е.Д. Орында ғ ан: Алтын А.Б. - презентация

1 «Астана медицина уничерситеті» А Қ жалпы иммунология кафедрасы Моноклонды антиденелер. Астана-2017 Қ абылда ғ ан: Даулетхан Е.Д. Орында ғ ан: Алтын А.Б. Тобы: 301ЖМ

2 Жоспар Гибридомды технологиямен танысу. Ә дісті ң ұ станымы. Моноклондарды алу. Тыш қ андардан жасанды ісік – гибридомалар – алу. Гибридомалардан ж ә не иммунды қ жасушалардан гибридты қ жасушаларды алу. Моноклоналды антиденелерді ал ғ анда ұ йымдастырылатын ж ұ мыстар ж ә не қ олданылатын құ рал-жабды қ тар. Сынау ғ а жануарларды та ң дау. Гибридомды технологиямен танысу. Ә дісті ң ұ станымы. Моноклондарды алу. Тыш қ андардан жасанды ісік – гибридомалар – алу.

3 Моноклонды антиденелердің алудың мақсаты: - Берілген арнайы антиденелерді т ү зетін шектеуші жасушалар клонын алу болатын. Б ұ л ма қ сатта 1975 жылы Г. Келлер мен Ц. Мальштейн қ алыпты лимфоциттер мен миелойдты жасушаларды ( я ғ ни, с ү йек кемігі жасушасынан дамитын ісік) қ оректі орталарда қ осып, гибрид ал ғ ан. Гиридома алу бірнеше кезе ң нен т ұ рады: Миелоидты линиясын алу; К ө кбауыр жасушаларын организімнен алу; Да қ ыл алу ү шін екі жасушаларды бір-бірімен қ осу; Жасушалар қ осыл ғ аннан кейін клондпрды алу; Осы кезе ң дерді азотты қ с ұ лы қ та консервациялап, дайындайды. Миелоидты жасушаларды тыш қ андардан алады.

4 Селекция ар қ ылы Г. Келлер, Ц. Мальштейн, керекті арнайылы ғ ы бар антиденелер синтездеуге (ал ғ аш қ ы антидене ө ндіруші жасуша ретінде) ж ә не жасанды ортада шексіз ө суге (миелома жасушалары ретінде) б ө ліп ал ғ ан. Д ә л осы жасушалы қ гибридтер тобын гибридома деп ата ғ ан. Индвидуалды жасушаны б ө ліп алып, да қ ылдандырып, клон алуына болады.

5 Ә дісті ң тарихы. Зерттеушілерді ң негізгі ма қ саты – ө згешелігі жо ғ ары антиденелерді алу ә дістерін табу. Бір белгілі жа ғ дайда бактериалды полисахаридтермен иммунизация ө ткізсе – ө згешелігі жо ғ ары антиденелерді ң жо ғ арыгомогенді аппаратын алу ғ а болады. Осыдан бас қ а, плазмацитоманы ң (антидене жарату жасушадан жаратыл ғ ан ісік) иммунды жануарды ң к ө к бауырыны ң жасушаларымен қ осылуы м ү мкін. Осылай гибридтік жасушалар (гибридомалар) алынады. Гибридомалар ісік жасушалардан шексіз к ө бею м ү мкіншілігін, ал к ө к бауырды ң жасушаларынан – белгілі ө згешелігі бар антиденелер синтездеу м ү мкіншілігін ал ғ ан. Моноклоналды антиденелерді синтездейтін гибридомаларды алу ә дісіне келесі методологиялы қ ж ұ мыстар жол берген: Миеломалар алу, оларды а ғ задан б ө лек ө сіру; Жасушаларды ң соматикалы қ гибридизация ә дісі.

6 Monoclonal Antibody Production Diagram

7

8 Ә дісті ң ұ станымы. Гибридомаларды алу ә дісті ң негізінде к ө кбауырды ң сенсибилизденген лимфоциттерді ң ж ә не миеломды жасушаларды ң қ осылуынан кейін гибридтік жасушаларды ң сериялы қ ө сіруі жатыр. Кейіннен керекті ерекшелігі бар антиденелерді секреттейтін клондарды іріктейді. Іріктелген клонды жасушаларды ң да қ ылдары ретінде са қ тайды немесе тыш қ андарды ң а ғ засында асцидтік ісік ретінде са қ тайды. Гибридомды технология бір неше кезе ң дерден т ұ рады: дайынды қ ж ұ мыстар, моноклондарды алу, клондарды са қ тау, реклондау, асцидтік ісік алу, антиденелерді тесттілеу, антиденелерді тазалау.

9

10 (1) иммунизация животных; (2) выделение В-лимфоцитов из селезенки; (3) культура клеток миеломы; (4) слияние В-лимфоцитов и клеток миеломы; (5) сегрегация клеточных линий; (6) скрининг и селекция линий, производящих антитела; (7) размножение гибридомы in vitro (a) или in vivo (b) ; (8) получение антител. Гибридомаларды алу ж ә не моноклоналды антиденелерді б ө ліп алу кестесі: Антиген е ң гізу. К ө к бауырды ң жас ұ шаларын алу (10 8 ). Миеломды жас ұ шаларды алу (10 7 ). ПЭГ 4000 ортасында жас ұ шаларды қ осу. ГАТ ортасында гибридомаларды іріктеу. Клондарды б ө ліп алу. Да қ ылды суйы қ ты қ ты антиденелер болуына тексеру. Пассаждарда реклондау. Да қ ылды суйы қ ты қ тан моноклоналды антиденелерді б ө ліп алу. Клонды -70 градуста са қ тау. Асциттік ісік алу.

11

12 Гибридомды технология: жасушалардың қосылуы, ГАТ-селекция, гибридомды анықтау

13

14 Гибридомаларды алу ж ә не моноклоналды антиденелерді б ө ліп алу кестесі

15 Тыш қ андарды ң ішіне бір неше рет к ө п уа қ ыт минерал майларымен ә сер етіп, оларды ң а ғ заларында миелома т ұ дырып, ж ұ мыс қ а жарамды миеломды жасушаларды алады. Осы жасушаларды ә дейленген зертханаларда да алады. Клондау ж ұ мыстарын жал ғ астыру ү шін ГАТ ортасына қ оректік жасушалар ретінде 500 мл орта ғ а 10 8 к ө кбауыр жасушаларын ж ә не 10 6 перитонеалды жасушаларды салады. Суспензияны 1 мл-ден 96- ұ ялы панельге құ йып к ө мір қ ыш қ ыл инкубаторда 37 градуста ұ стайды. Ә р бір ү ш т әү ліктен кейін ортаны ауыстырып отырып, жасушалардын ө мірге жарамды ғ ын тексереді. Да қ ылды с ұ йы қ ты қ та секреттейтін клон болса моноклоналды антиденелер жаратылады. Іріктеліп алын ғ ан гибридоманы ң клонын келесі микрода қ ылдарда реклондайды. Да қ ылды с ұ йы қ ты қ ты ң құ рамында моноклоналды антиденелер болса, оларды эксперименттерде, иммунодиагностикумдарды дайындау ү шін биотехнологиялы қ ү дірістерде қ олданады.

16

17

18 Ж ұ мыстарды ұ йымдастыру ж ә не қ олданылатын құ рал-жабды қ тар. Гибридомаларды алу ж ұ мыстарын б ө лек б ө лмеде ө ткізеді. Келесі құ рал-жабды қ тар болу керек: Ламинарлы бокс. Бір белгілі м ө лшерде ыл ғ алды, температураны, к ө мір қ ыш қ ыл газды ұ стап т ұ ратын инкубатор. Центрифуга. Микроскоптар. +4 ж ә не -200 градус ұ стайтын холодильник. +37 ж ә не +560 градуста ж ұ мыс істейтін су моншасы. Осыдан бас қ а б ө лек б ө лмеде жас ұ шалар са қ тау ү шін -700 градусты то ң азыт қ ыш ж ә не суйы қ азоты бар Дьюар ыдысы болу керек. Гибридомаларды алу ү шін жас ұ шаларды ң да қ ылдарына арнал ғ ан ә дейленген пластикалы ыдыстарды дайындап қ ою керек. Олар: т ү бі тегіс 96- ұ ялы планшеталар, 24- ұ ялы планшеталар, к ө лемі 25, 75 см 2 пластикалы ыдыстар, культивирлеуге арнал ғ ан орталар, керекті реактивтер.

19

20 Экспериментке жануарды та ң дау. Иммунизация ғ а тышкандармен ж ә не егеу құ йры қ тылармен қ олданады. Осы жануарларды ң а ғ заларында миеломды жасушалар жа қ сы ө седі. Бас қ а жануарлармен қ олданбайды. Реклондау – клондарды дамыту. Тірі қ ал ғ ан гибридомды жасушаларды олар иммуноглобулиндер шы ғ ара баста ғ анша реклондайды. Іріктеп ал ғ ан гибридтік жасушаларды 1, 10, 100, 1000 жасушалардан ұ ялар ғ а салады. Моноклоналды антиденелер 12 к ү ннен кейін жаратыла бастайды. Керекті клонды 20 мл ГАТ ортасына салады, сол пассажда са қ тайды. 5 – 15 пассаж ө ткеннен кейін моноклоналды антиденелерді ң м ө лшері е ң к ө п болады. Клонны ң ө мірге жарамды ғ ы қ оректік ортаны ң қ оректік жасушаларына байланысты.

21 Моноклоналды антиденелерді шы ғ аратын клондарды , қ ай бір кезде 30 пассаж ғ а дейін апарып дамыту ғ а болады. Кейіннен олар ө мірге жарамды болады, біра қ ерекше иммуноглобулиндерді синтездемейді. Антидене шы ғ аратын клондарды ң к ө лемі антигендік препараттарды ң қ асиетімен байланысты болып пайыз құ райды. Клондар М- ж ә не G-класс иммуноглобулиндерді синтездейді. Іріктеліп ал ғ ан клонды са қ тау керек. Іріктелген клондарды ң бір б ө легін -70 градус құ рамында МДСИ, 20 пайыз қ анны ң сары суы, 10 пайыз диметилсульфоксид бар ортада қ атырады. Екінші б ө легін осы ортада суйы қ азотта са қ тайды, клонды ң та ғ ы бір б ө легін тыш қ андарда асцидтік ісік т ұ дыру ғ а жібереді. Іріктелген клонды асы қ пай, абайлап, кезе ң мен қ атырады. Жасушаларды еріткенде жылдам 40 градуста су моншасында ерітеді.

22 Асцидтік ісікті алу. Жануарлардан гибридомалар алу ү шін, оларды ң қ арындарыны ң ішіне гибридтік жас ұ шалар жаратылу ма қ сатымен 0,5 мл тристан (тетраметилпептадекан) немесе Фрейнд адьювантын ж ә не т ұ зды буфердегі керекті клонны ң жуыл ғ ан 1 – 2 мл (1 мл – 10 жас ұ ша) жас ұ шаларын е ң гізеді. Тыш қ анны ң ішінде ісік белгіленеді. Асцидтік суйы қ ты қ та моноклоналды антиденелерді аны қ тайды. Тыш қ анны ң қ аныны ң сары суында ж ә не асцидтік суйы қ ты қ та иммуноглобулиндерді ң к ө лемі 3 15 г/л, ал моноклоналды антиденелер – 50 мг/л. Бір тыш қ аннан 10 мл асцидтік суйы қ ты қ ты алады. Асцидтік суйы қ ты қ ты кейіннен та ғ ын ісік алу ғ а жіберуге болады (айына 1 рет) ж ә не серологиялы қ реакцияларда антигенді аны қ та ғ анда қ олданады.

23

24 Моноклоналды антиденелерді тесттілеу. Моноклоналды антиденелерді аны қ тау ү шін сезімталды тест- ж ү йелермен қ олданады: радиоиммунологиялы қ, иммунофлуоресценттік, иммуноферменттік. Моноклоналды антиденелерді тесттілеуге арнал ғ ан тест- ж ү йелерді ң компоненттері – тыш қ анны ң антисары суы ж ә не антигенді препараттар. Олар к ө п болу керек, неге десек, ә р бір 3 к ү нде ә р бір ұ яны ң құ рамын моноклоналды антиденелерін барына зерттейді. Осындай тесттілеуді сканирование деп атайды. Бірінші сканирование қ осылу ө ткеннен кейін он екінші к ү нде ө ткізіледі. Он реакция беретін гибридті жасушаларды пассаж ғ а ауыстырып, бір ұ яда бір клон бол ғ анша к ө лемін арттырады.

25 Антиденелерді тазалау. Алын ғ ан да қ ылды ң ж ә не асцидтік суйы қ ты қ ты ң құ рамында моноклоналды антиденелерден бас қ а компоненттер болады. Оларды жою керек. Иммуноглобулин М б ө ліп ал ғ анда да қ ылды суйы қ ты қ ты ң 100 мл 28 гр аммоний сульфатын салады (45 пайызды қ ерітінді). Қ оспаны 12 са ғ ат 4 градуста са қ тайды, 20 минут об/мин центрифугаттайды. Т ұ нбаны 45 пайызды аммоний сульфатымен жуады, 10 мл 0,05М тристан буферінде орнына келтіреді, сефароза бар хроматографиялы қ колонкасынан ө ткізеді, 0,1М альфаметилгликозиді бар 0,05М трисбуфермен жуады. Моноклоналды антиденелерді ң кейінгі қ олдануы оларды ң титрімен, аффиндігімен, ерекшелігімен байланысты.

26

27 Аффиндік – антиденені ң ж ә не антигенді детерминантаны ң қ атынасу де ң гейі. Моноклоналды антиденені ң титрі т ө мен, аффиндігі ә р т ү рлі болады. Иммунохимияда ж ә не аффинді хроматографияда т ө менаффинді моноклоналды антиденелермен қ олдану ғ а болады, біра қ ИФА сараптау ғ а моноклоналды антидене жо ғ ары аффинді болу керек. Диагностикалы қ ма қ сатымен моноклоналды антиденені ң бір неше клондарыны ң кешендерін қ олданады. Моноклоналды антиденелермен таза т ү рінде қ олданбайды. Оларды ферменттермен ж ә не радиоизотоптармен та ң балап ИФА ж ә не РИА сараптауда қ олданады.

28 Қазіргі кездегі гендік инженерия жетістіктері жаңа, гуманизацияланған моноклонды антиденелер дайындауға мүмкіндік береді Олар адамның әр түрлі патологиялық жағдайларында иммунды емде қолданатын жаңа арнайы дәрілік препараттарды дайындалуында өте переспективті.Оларды тышқанның моноклонды антиденелерінің V-гендері мен адамдардың иммуноглобулиндердің керекті изотиптік C-гендерімен қосы, дайындайды; ол гибридтік антиденелердің арнайлығы тышқанның, ал антигендік қасиеті- адамның генднрімен анықталады.

29 Моноклонды антиденелердің қолдану аймағы әр түрлі болуы мүмкін: Мысалы: - Қ ан н ә руыздарында; -Гормондар ғ а; -Арнайы антиген тіндерінде; -Ісік ж ә не қ алыпты жасушалар ғ а; -Вирустар ғ а, бактериялар ғ а, паразиттерге, химиялы қ қ осылыстар ғ а ж ә не т. б. Қ арсы антиденелер болуы м ү мкін.

30 Моноклонды антиденелердің қолданылуы: Клиникада моноклонды антиденелер адамны ң иммунды қ статусын ба ғ алауында; Лимфоциттерді ң субпопуляцияларын іріктеуінде; Ісік метастаздарын аны қ тауда; Белгілі бір антигендерге моноклонды антиденелер адамдағы жедел лейкоздың түрін дифференциялануынд; Жасушалық улармен коньюгацияланған иммунотоксин ретінде қатерлі ісіктерін бірнеше түрін арнайы емдеуде қолданылады;

31 Қолданылған әдебиет Воронин Е.С., Петров А.М., Серых М.М., Девришов Д.А. Иммунология.- М. Колос-Пресс, с. Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А, Сидорович И.Г. Иммунология.- М.: Медицина, с. Радчук Н.А., Дунаев Г.В., Колычев Н.М. и др. Ветеринарная микробиология и иммунология.- М.: Агропромиздат, с. Алехин Р.М., Бакулов И.А., Третьяков А.Д. Ведерников В.А. и др. Руководство по общей эпизоотологии. Под ред. И.А.Бакулова, А.Д.Третьякова.- Москва: Колос с Алешукина А.В. Медицинская микробиология. Ростов-на-Дону: «Феникс» Микробиология и иммунология. Под ред. А.А.Воробьева. М.: «Медицина» Муромцев Г.С. и др. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. Москва ВО «Агропромиздат» Никитин Е.Б. Основы биотехнологии. Павлодар Гилберт С.. Биология развития. В 3-х томах. Биология развития. М. Мир Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М. Мир с. Корочкин Л.И. Биология индивидуального развития(Генетический аспект) М. МГУ с. Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Воронин Е.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. 2-е изд. М. Высшая школа