Современные методы лабораторной диагностики туберкулёза. - презентация

1 Современные методы лабораторной диагностики туберкулёза

2 Туберкулез. Обследование пациентов с целью дифференциальной диагностики туберкулеза внелегочной локализации. Туберкулез. Обследование пациентов с целью дифференциальной диагностики туберкулеза внелегочной локализации. Туберкулез-инфекционное заболевание,возбудителем которого почти в 95% случаев является Mycobacterium tuberculosis. Обследованию подлежат больные с длительными хроническими процессами, с выраженными клинико-лабораторными и рентгенологическими показаниями и рефракторные к неспецифической антибактериальной и/или другим методам терапии. В случае пациентов с ВИЧ инфекцией или иных случаев иммунодефицитных и иммуносупрессивных состояний, при проявлении симптомов заболеваний внелегочной локализации необходимо проведение исследований для исключения диагноза «туберкулез» или «микобактериоз ».

3 Молекулярно-генетические методы диагностики туберкулеза. Сокращение сроков выявления возбудителя, видовой идентификации и определения лекарственной резистентности микобактерий может быть достигнуто за счет применения в лабораторной практике молекулярно-генотипических методов. Их использование в диагностике туберкулеза позволяет в кратчайшие сроки установить резистентность МБТ к противотуберкулезным препаратам при госпитализации больного в стационар, выявлять микобактерии не туберкулезного комплекса, назначать правильное лечение с самого начала, что повышает эффективность терапии, предотвращает распространение штаммов микобактерий, резистентных к лекарственным средствам. Основой молекулярно-генетических методов диагностики туберкулеза является полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая получила широкое распространение для выявления различных инфекционных агентов, в том числе микобактерий. Тесты амплификации нуклеиновых кислот позволяют установить очень небольшое количество микроорганизмов. Сокращение сроков выявления возбудителя, видовой идентификации и определения лекарственной резистентности микобактерий может быть достигнуто за счет применения в лабораторной практике молекулярно-генотипических методов. Их использование в диагностике туберкулеза позволяет в кратчайшие сроки установить резистентность МБТ к противотуберкулезным препаратам при госпитализации больного в стационар, выявлять микобактерии не туберкулезного комплекса, назначать правильное лечение с самого начала, что повышает эффективность терапии, предотвращает распространение штаммов микобактерий, резистентных к лекарственным средствам. Основой молекулярно-генетических методов диагностики туберкулеза является полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая получила широкое распространение для выявления различных инфекционных агентов, в том числе микобактерий. Тесты амплификации нуклеиновых кислот позволяют установить очень небольшое количество микроорганизмов.

4 Метод дает возможность обнаружить возбудителя даже при наличии лишь десятков или сотен микроорганизмов в 1 мл исследуемого материала. Принцип метода ПЦР заключается в амплификации многократном увеличении участков специфической последовательности ДНК микобактерий в пробирковом микрообъеме. Многократное удвоение специфических фрагментов ДНК приводит к увеличению их количества в геометрической прогрессии до уровня, который позволяет осуществить детекцию существующими методами. Результаты ПЦР оценивают с помощью различных методов гибридизации продукта со специфическими комплементарными мечеными ДНК-зондами. При условии оптимального выбора гена для амплификации или нуклеотидной последовательности гена этот метод позволяет с высокой специфичностью идентифицировать возбудителя. Тесты амплификации быстрые и безопасные. Преимуществами метода являются его высокая специфичность (98-100%), скорость (результат за 2,5-3,5 ч), высокая чувствительность у пациентов с положительным мазком мокроты (более 95%), возможность проведения исследования любых биологических материалов. К недостаткам метода относятся сложность интерпретации результатов (требующая специальной подготовки), высокая стоимость, низкая чувствительность у больных с отрицательным мазком мокроты (60-70%). Однако именно сложность интерпретации результатов стала ограничением к его широкому внедрению в клиническую практику

5 Тест система гибридизации с типоспецифичными зондами GenoType (технология ДНК-стропов), тест система GeneXpertMTB/RIF. Тест система GeneXpertMTB/RIF рекомендованная ВОЗ при поддержке FIND к использованию в диагностике туберкулеза только с 2010 года. Тест система Gene XpertMTB/RIF является полуколичественной гнездовой ПЦР в реальном времени в картриджи, и ее проводят с целью выявления ДНК МБТ в образцах мокроты или концентрированных осадках мокроты; мутаций резистентности к рифампицину в образцах, полученных от пациентов с риском развития резистентности к этому препарату. GeneXpertMTB/RIF тест система закрытого типа; выделение и амплификацию выполняют в одноразовом картридже, предварительная обработка диагностического материала сводится к минимальным манипуляциям. Это позволяет значительно уменьшить возможность контаминации материала. По данным ВОЗ, резистентность к рифампицину коррелирует с резистентностью к изониазиду. Резистентность к рифампицину и изониазиду (мультирезистентность) обычно свидетельствует о необходимости одновременного проведения полного тестирования на чувствительность к препаратам І и II ряда, но это возможно только после выделения культуры микобактерий. Результат обрабатывают на компьютере и распечатывают (позитивный/негативный, резистентность к рифампицину есть/нет).

6 Преимуществами метода является скорость (весь процесс длится менее 2 ч), высокая специфичность (100%), высокая чувствительность для пациентов с положительным мазком мокроты (98%), простота (необходимый минимальный уровень навыков), отсутствие потребности в отдельных помещениях для проведения ПЦР. К недостаткам метода относятся возможность определения устойчивости возбудителя только к одному противотуберкулезному препарату рифампицину, что предопределяет необходимость дальнейших исследований для диагностирования мультирезистентности; возможность использования только нативной мокроты и концентрированных ее образцов (продолжаются исследования по применению других биологических образцов); высокая стоимость исследований. Учитывая вышеуказанные ограничения метод используется как скрининговый для обследований групп населения с высоким риском мультирезистентного туберкулеза (ранее леченые лица; те, что контактировали с больными мультирезистентным туберкулезом; ВИЧ инфицированные) с целью принятия своевременного решения по изоляции таких пациентов и назначения правильного лечения. Преимуществами метода является скорость (весь процесс длится менее 2 ч), высокая специфичность (100%), высокая чувствительность для пациентов с положительным мазком мокроты (98%), простота (необходимый минимальный уровень навыков), отсутствие потребности в отдельных помещениях для проведения ПЦР. К недостаткам метода относятся возможность определения устойчивости возбудителя только к одному противотуберкулезному препарату рифампицину, что предопределяет необходимость дальнейших исследований для диагностирования мультирезистентности; возможность использования только нативной мокроты и концентрированных ее образцов (продолжаются исследования по применению других биологических образцов); высокая стоимость исследований. Учитывая вышеуказанные ограничения метод используется как скрининговый для обследований групп населения с высоким риском мультирезистентного туберкулеза (ранее леченые лица; те, что контактировали с больными мультирезистентным туберкулезом; ВИЧ инфицированные) с целью принятия своевременного решения по изоляции таких пациентов и назначения правильного лечения.

7 Тест система GenoType используют только в лабораториях для микробиологической диагностики туберкулеза III уровня, и она предназначена для диагностики туберкулеза с идентификацией микобактерий и определением чувствительности к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам, аминогликозидам/циклическим пептидам и этамбутолу. Тест-система GenoType предназначена для обследования следующих групп пациентов со строгим соблюдением определенной последовательности и приоритетности. В качестве первичного диагностического теста независимо от результата бактериоскопии на КУБ (положительный и отрицательный мазок): ВИЧ инфицированные пациенты с подозрением на туберкулез; пациенты с подозрением на легочный туберкулез с риском наличии мультирезистентного туберкулеза (группы риска согласно национальному протоколу); лица, которые контактируют с больными мультирезистентным туберкулезом; пациенты, которые ранее получали лечение по поводу туберкулеза и которым повторно установлен диагноз легочного туберкулеза (неэффективная терапия, рецидив, отрыв), больные с рецидивом, после неудачи лечения или отрыва при отсутствии в анамнезе данных о резистентность к рифампицину и изониазиду; пациенты, которые родились в стране с высоким уровнем заболеваемости; дети-подростки (возрастная группа 0-17 лет) с подозрением на туберкулез. Тест система GenoType используют только в лабораториях для микробиологической диагностики туберкулеза III уровня, и она предназначена для диагностики туберкулеза с идентификацией микобактерий и определением чувствительности к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам, аминогликозидам/циклическим пептидам и этамбутолу. Тест-система GenoType предназначена для обследования следующих групп пациентов со строгим соблюдением определенной последовательности и приоритетности. В качестве первичного диагностического теста независимо от результата бактериоскопии на КУБ (положительный и отрицательный мазок): ВИЧ инфицированные пациенты с подозрением на туберкулез; пациенты с подозрением на легочный туберкулез с риском наличии мультирезистентного туберкулеза (группы риска согласно национальному протоколу); лица, которые контактируют с больными мультирезистентным туберкулезом; пациенты, которые ранее получали лечение по поводу туберкулеза и которым повторно установлен диагноз легочного туберкулеза (неэффективная терапия, рецидив, отрыв), больные с рецидивом, после неудачи лечения или отрыва при отсутствии в анамнезе данных о резистентность к рифампицину и изониазиду; пациенты, которые родились в стране с высоким уровнем заболеваемости; дети-подростки (возрастная группа 0-17 лет) с подозрением на туберкулез.

8 В качестве вторичного диагностического теста после бактериоскопии на КУБ (положительный мазок): больные туберкулезом с отрицательной клинико- рентгенологической динамикой и/или продолжением или возобновлением бактериовыделения (с целью ускорения выявления вторичной медикаментозной резистентности МБТ во время лечения); пациенты из социальных групп риска, в которых вы явлено легочный туберкулез методом бактериоскопии; больные с впервые диагностированным туберкулезом методом бактериоскопии. Для исследования используют исследовательский материал (позитивный образец мокроты, подтвержден бактериоскопически; культура микобактерий, что выросла на жидкой и/или плотной питательной среде). В качестве вторичного диагностического теста после бактериоскопии на КУБ (положительный мазок): больные туберкулезом с отрицательной клинико- рентгенологической динамикой и/или продолжением или возобновлением бактериовыделения (с целью ускорения выявления вторичной медикаментозной резистентности МБТ во время лечения); пациенты из социальных групп риска, в которых вы явлено легочный туберкулез методом бактериоскопии; больные с впервые диагностированным туберкулезом методом бактериоскопии. Для исследования используют исследовательский материал (позитивный образец мокроты, подтвержден бактериоскопически; культура микобактерий, что выросла на жидкой и/или плотной питательной среде). больные туберкулезомбольные туберкулезом