Казахский национальный университет имени аль – Фараби Выполнили: Әнуарбек Шынар, Тумашбаева Айгерим, Мурзина Елена, ПБТ 105 Р Алматы 2013 год. - презентация

1 Казахский национальный университет имени аль – Фараби Выполнили: Әнуарбек Шынар, Тумашбаева Айгерим, Мурзина Елена, ПБТ105Р Алматы 2013 год

2 Ti-плазмида (Ti-plasmid, tumor inducing plasmid) - плазмида почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens, специфический Т-участок которой способен включаться в клетки двудольных растений и внедряться в их ядерную ДНК, что ведет к образованию специфических опухолей (галлов); содержит гены, контролирующие синтез редких аминокислот (опинов) – октопина, нопалина, агропина; элементы Ti-плазмид широко используются в качестве векторов в генной инженерии растений. Ti-плазмида Ген вирулентности Цитокинин Опин ДНК Точка начала репликации Ауксин Agrobacterium tumefaciens 1

3 Плазмиды бактерий – кольцевые молекулы ДНК, несущие небольшое количество генов и присутствующие в бактериальной клетке наряду с хромосомной ДНК). Именно плазмиды чаще всего применяются для трансформации растений. Инфицирование растений A. tumefaciens и образование корончатого галла 2

4 Корончатый галл злокачественная опухоль, вызванная агробактериями (Agrobacterium tumefaciens) на ветке сирени. Ti-плазмида Т-ДНК хромосомы Агробактерия 3

5 Молекулярно – генетические механизмы агробактериальной трансформации Процесс трансформации можно разделить на четыре этапа: прикрепление бактерии к стенке растительной клетки проникновение Т-ДНК внутрь клетки растения интеграция Т-ДНК в геном растения и экспрессия Т-ДНК Индукция начальных этапов трансформации может происходить только в месте раневого повреждения растения, где выделяются низкомолекулярные фенольные соединения (например, ацетосирингон), углеводы (например, глюкоза и глюкуроновая кислота) и где образуется кислый рН. 4

6 Уникальные свойства плазмид – 1. Содержат гены, позволяющие бактериям выжить в изменяющихся условиях окружающей среды 2. Токсичность для других бактерий (колицины) 3. Прикрепление к субстрату 4. Освоение новых источников углерода 5. Способность к автономной репликации Недостатки плазмид как векторов – Небольшая емкость, не более нескольких тысяч п.н. Нестабильность при включении больших фрагментов 5

7 Для заражения растений наиболее важным оказывается Vir-район, в котором закодировано довольно много генов. Постоянно работают только два гена: VirA и VirG. Белок VirA это рецептор на ацетосирингон. Белок VirA реагирует на ацетосирингон и передаёт сигнал на белок VirG, который активирует все остальные гены Vir-района. В результате: 1) клетки агробактерий плывут к месту поражения (ориентируясь по увеличению концентрации ацетосирингона); 2) Ti-плазмида начинает размножаться и передаваться другим бактериям того же вида; 3) появляются другие белки- продукты генов Vir-области 6

8 Белок VirD1 совместно с белком VirD2 находят в Ti-плазмиде определённые участки, состоящие из 25 пар нуклеотидов, и разрезают их, перебрасывая ковалентную связь с конца ДНК на белок VirD2. У Agrobacterium tumefaciens таких участков два: они ограничивают Т-район. Одна из цепей ДНК отделяется и уходит; таким образом, в Ti-плазмиде возникает брешь. Специальная система репарации ДНК застраивает брешь новой цепью ДНК, и из той же Ti-плазмиды можно ещё раз вырезать Т-район, Ti-плазмида в целом сохраняется. Одноцепочечная Т-ДНК, связанная с белком VirD2, в дальнейшем «одевается» при помощи белка VirE2, который не даёт ферментным системам бактериальной клетки разрушить одноцепочечную Т-ДНК. Специальная система репарации ДНК застраивает брешь новой цепью ДНК, и из той же Ti-плазмиды можно ещё раз вырезать Т-район, Ti-плазмида в целом сохраняется. Одноцепочечная Т-ДНК, связанная с белком VirD2, в дальнейшем «одевается» при помощи белка VirE2, который не даёт ферментным системам бактериальной клетки разрушить одноцепочечную Т-ДНК. 7

9 На поверхности клетки агробактерии при помощи разнообразных белков VirB образуется аппарат для переноса ДНК из одной клетки в другую. Именно белки VirB отвечают за перемещение комплекса VirD2 с одноцепочечной ДНК из клетки агробактерии в клетку растения. Белки VirE2 также перемещаются в клетку хозяина. Далее комплекс одноцепочечной Т-ДНК с белками VirD2 и VirE2 проникает в ядро растительной клетки. Белок VirD2 «надрезает» ДНК клетки-хозяина и встраивает Т-ДНК из Ti-плазмиды. Таким образом, происходит процесс встраивания чужеродной ДНК в ДНК клетки растения. После этого клетку растения можно считать генетически модифицированной. В процессе эволюции агробактерии «разработали» механизм получения генетически модифицированных клеток растения, т. е. стали природными «генными инженерами». 8

10 Гены, которые содержатся в Т-районе, в самой клетке агробактерии не работают, поскольку у них есть только эукариотические промоторы. Два из этих генов отвечают за биосинтез ауксинов: iaaH и iaaM. Ещё один ген iptZ кодирует ключевой фермент синтеза изопентениладенина (одна из форм цитокининов). Таким образом, попав в геном растения, Т-ДНК вызывает синтез как ауксинов, так и цитокининов. При этом клетки растения-хозяина начинают неорганизованно делиться, образуя опухоль. После вставки Т-района в клетке растения-хозяина начинается неконтролируемый синтез ауксинов, цитокининов и опинов. 9

11 Опинов достаточно много, и каждая Ti-плазмида обеспечивает синтез своего опина (нопалина, агроцинопина, витопина, куркумопина и др.). В самой Ti-плазмиде (но не в Т-районе!) есть гены, отвечающие за «переваривание» соответствующего опина. Это объясняет, почему одна Ti-плазмида, захватив клетку агробактерии, не пускает в неё другую Ti-плазмиду, отвечающую за синтез и метаболизм другого опина. После внедрения ДНК из Т-района клетки опухоли интенсивно делятся и продуцируют именно тот опин, который способна «переварить» агробактерия, вызвавшая данную инфекцию. Если в почве обитают два разных вида агробактерий, то при инфекции первая бактерия каким-то образом не пускает другую, которая питается иным опином. Структура Ti -плазмиды 10

12 Итак, в результате переноса Т-ДНК из Ti-плазмиды в клетку растения- хозяина происходит неконтролируемое образование гормонов (ауксинов и цитокининов), что приводит к злокачественному росту клеток и дальнейшему синтезу азотсодержащих веществ опинов. К месту опухоли притекает всё больше и больше аминокислот, но они постоянно «выводятся из оборота» растения, т. к. преобразуются в новые порции опинов, которые служат источником питания для соответствующего штамма агробактерий. «Избавиться» от чужеродной ДНК растительные клетки уже не могут. Рост клеток и синтез опинов продолжаются даже в том случае, когда агробактерии по каким-либо причинам погибли. Растительная клетка Agrobacterium tumefaciens Ti-плазмида хромосома Т-ДНК 11

13 Т-ДНК Ti-плазмид обладает двумя свойствами, делающими ее по существу идеальным вектором для введения чужеродных генов в клетки растений. Во-первых, круг хозяев агробактерий очень широк: они трансформируют клетки практически всех двудольных растений. Известно, что можно добиться заражения однодольных, в том числе злаков. Во-вторых, интегрированная в состав генома растения Т-ДНК наследуется как простой доминантный признак в соответствии с законами Менделя, а ее гены имеют собственные промоторы (регуляторная область гена, определяющая время и место его экспрессии), под контролем которых могут экспрессироваться вставленные в Т-ДНК чужеродные гены. 12

14 Размеры целой Ti-плазмиды существенно больше размеров молекул, обычно используемых в работе с рекомбинантной ДНК. Чтобы преодолеть эту трудность, разработан следующий подход. Прежде всего Т-сегмент вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в один из стандартных плазмидных векторов для размножения в клетках бактерий - Escherichia coli. E. coli содержит плазмиду pBR322, которая способна к саморепликации, то есть размножению, приводящему к увеличению числа ее копий. После того как в плазмиду pBR322 внедрили участок Ti-плазмиды, это рекомбинантная структура может затем реплицироваться многократно, что приводит к увеличению числа копий участков Ti-плазмиды. Этот процесс называется клонированием. Бактерии, содержащие плазмиду pBR322 с участком Т-ДНК, размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затем с использованием рестриктаз и стандартных приемов работы с рекомбинантной ДНК в Т-сегмент встраивают определенный ген. 13

15 Этот молекулярный гибрид, теперь уже содержащий Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают в E. coli, а затем вводят в клетки A. tumefaciens, несущие соответствующую полную Ti- плазмиду. В результате обмена идентичными участками (гомологичная рекомбинация) между Т-сегментами нативной и сконструированной Ti- плазмид Т-ДНК со встроенным чужеродным геном включается в Ti- плазмиду, замещая нормальную Т-ДНК. Таким образом, мы получаем клетки A. tumefaciens, несущие Ti-плазмиду со встроенным в Т-сегмент нужным геном. Последний этап заключается в заражении растений этими модифицированными генно-инженерными методами агробактериями. 14

16 Недавние исследования, однако, показали, что эту процедуру можно упростить, если использовать бинарные векторные системы, создание которых заключается в том, что агробактериальная клетка должна содержать по крайней мере две разные модифицированные Ti- плазмиды. Одна из них должна содержать только vir-область, гены которой будут участвовать в вырезании Т-ДНК. Такие плазмиды называют плазмидами-помощницами. 15

17 Вторая Ti-плазмида должна содержать область Т-ДНК с нужным встроенным геном. Продукты vir-генов способны вырезать Т- ДНК как на собственной плазмиде, так и на соседней, то есть vir-гены могут работать вне зависимости от их местоположения. Таким образом, если клетки агробактерии содержат Ti-плазмиду с сегментом vir и другую плазмиду с Т-ДНК, несущей встроенный ген, эти бактерии могут трансформировать клетки растений 16

18 Несмотря на то что Ti-плазмиды являются эффективными природными векторами, их использование имеет некоторые ограничения. Наиболее существенные из них следующие: 1. Ауксин и цитокинины, синтезируемые трансформированный ми Ti-плазмидами клетками, подавляют регенерацию зрелых растений из этих клеток. Следовательно, при конструировании векторов на основе Ti-плазмид гены ауксина и цитокинина должны быть удалены. 2. Ti-плазмиды имеют очень большой размер ( тыс. нуклеотидных пар), а для экспериментов с рекомбинантными ДНК нужны векторы меньшего размера. Следовательно, участки ДНК, несущественные для клонирующего вектора, должны быть удалены. 3. Ti-плазмиды не реплицируются в кишечной бактерии Escherichia coli (именно в этих бактериях производят клонирование созданного вектора для получения множества его копий, которые в дальнейшем и будут использовать для трансформации растительных клеток). Следовательно, при конструировании векторов необходимо ввести в них сайт инициации репликации, обеспечивающий их воспроизводство в Е. coli. 17

19 Кроме манипуляций, связанных с удалением из Ti-плазмид определенных участков ДНК и введения в них сайта инициации репликации кишечной бактерии, в вектор включают специальный ген, который позволяет идентифицировать трансформированныйе клетки. Он дает возможность обнаружить клетки растений, несущие чужеродную ДНК в составе геномной ДНК трансформированного растения. Эти гены позволяют либо проводить отбор трансформированныйх клеток в этом случае они называются селективными маркерными генами, либо оценивать активность кодируемого ими фермента регуляторные гены. Испытано несколько десятков генов, которые можно использовать как селективные маркерные гены, и репортерных генов, чей белковый продукт можно обнаружить с помощью специальных методов. 18

20 Как правило, в качестве репортерных используют бактериальный плазмидный ген фермента, который обеспечивает устойчивость трансформированныйх растительных клеток к тому или иному антибиотику. Чаще всего это ген неомицинфосфотрансферазы, обеспечивающий устойчивость к канамицину. В качестве селективных маркерных генов используют гены, которые кодируют ферменты, обеспечивающие устойчивость растительных клеток к антибиотикам или гербицидам. Так, в присутствии ка-намицина выживают только те клетки, которые синтезируют активную неомицинфосфотрансферазу. 19

21 Поскольку этот ген бактериальный (прокариотический) и не может экспрессироваться в растениях, его ставят под контроль растительных (эукариотических) сигналов регуляции транскрипции, в том числе промотора и терминатора. Это обеспечивает эффективную экспрессию гена в трансформированныйх растительных клетках. Однако следует отметить, что, по мнению экспертов-биотехнологов, присутствие некоторых генов и их продуктов может приводить к загрязнению коммерческого продукта. В связи с этим лучше не вводить гены устойчивости к антибиотикам в сельскохозяйственные растения. 20

22 Таким образом, осуществив всё необходимые модификации Ti-плазмид, получают вектор, пригодный для трансформации клеток растений. Все векторы на основе Ti-плазмид организованы сходным образом и кроме кассеты экспрессии содержат следующие элементы: селективный маркерный ген, который обеспечивает устойчивость трансформированныйх клеток к антибиотикам; сайт инициации репликации, который позволяет плазмиде реплицироваться в Е. coli. Некоторые векторы содержат также и сайт инициации репликации A. tumefaciens;. правая фланкирующая последовательность Т-ДНК, которая абсолютно необходима для интеграции Т-ДНК в клеточную ДНК растений; полилинкер (множественный сайт клонирования) для встраивания гена в участок между границами Т-ДНК. 21

23 Источники информации: /Ti htm html ya_gmrasteni.html design=print html design=print