Цитокинодиагностика: прошлое, настоящее и будущее Тотолян Арег Артемович Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Национальные. - презентация

1 Цитокинодиагностика: прошлое, настоящее и будущее Тотолян Арег Артемович Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Национальные дни лабораторной медицины России-2011 Москва, 5 октября 2011 года

2 Цитокины – регуляторные белки, секретируемые лейкоцитами крови и другими клетками организма человека, плейотропные эффекты которых включают регуляцию клеток иммунной системы и модуляцию воспалительной реакции

3 ЦИТОКИНЫ Интерлейкины Факторы некроза опухолей Интерфероны Колониестимулирующие факторы Факторы роста негемопоэтических клеток Хемокины Конститутивные Индуцибельные –провоспалительные –противовоспалительные

4 Основные характеристики действия цитокинов ХарактеристикаКомментарии ПлейотропностьБольшинство цитокинов имеют много клеток-мишеней Избыточность эффектовОдин цитокин имеет множество биологических эффектов Синергизм/АнтагонизмОдновременное влияние на клетки двух или нескольких цитокинов может привести к качественно различным эффектам Цитокиновый каскадЦитокины могут повысить (или снизить) продукцию других цитокинов Модуляция рецепторовЦитокины могут повысить (или снизить) экспрессию рецепторов для других цитокинов

5 МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СИСТЕМЫ ЦИТОКИНОВ СИНТЕЗ молекулярно-биологические – мРНК – планарные микрочипы иммунохимические – проточная цитометрия внутриклеточное содержание – иммуноцитохимический ПРОДУКЦИЯ иммунохимические – ИФА – проточная цитометрия концентрация (мультиплексный анализ) БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ биологические – хемотаксис – пролиферация – дегрануляция и т.д. СИНТЕЗ молекулярно-биологические – мРНК – планарные микрочипы ЭКСПРЕССИЯ иммунохимические – проточная цитометрия Рецепторы цитокинов Цитокины

6 Клеточные линии для оценки биологической активности цитокинов ЦитокиныКлеточные линии Способ оценки активностиДругие цитокины, активные в данном тесте ИЛ-1Перв.культ.ПролиферацияИЛ-2, ИЛ-6; ИЛ-4, ФНО D10SПролиферацияИЛ-2 CTLL-2Пролиферация ИЛ-15, ТФР ИЛ-3TF-1ПролиферацияИЛ-4,5,9,13, ГМ-КСФ ИЛ-4CTLL-2Пролиферация ИЛ-15, ТФР ИЛ-6B9ПролиферацияИЛ-11, ИЛ-13 ИЛ-8Перв.культ.МиграцияНекоторые хемокины ИЛ-12KIT-225ПролиферацияИЛ-2,4,7,15,21 ИЛ-18KG-1Синтез ИФН-γИЛ-12, ИЛ-21 ФНОL929ЦитотоксичностьЛимфотоксин ГМ-КСФTF-1ПролиферацияИЛ-3,4,5,9,13, ЭПО ИФН-αПерв.культ.Антивирусная активностьДругие типы ИФН, видоспецифично А-549, 2D9, Daudi Антивирусная активность, продукция белка MxA ИФН-γА-549Антивирусная активностьДругие типы ИФН WiDrПодавление пролиферации-

7 Сравнительный анализ методов определения цитокинов ХарактеристикаБиологические методыИммунохимические методы Выявляеттолько биологически активные молекулы число доступных эпитопов (биологически активные и неактивные молекулы) Специфичностьнедостаточная (биологически активности различных цитокинов интерферируют); необходимо подтверждать с помощью нейтрализующих антител очень высокая Интерференцияспецифические и неспецифические нативные ингибиторы цитокинов, антицитокиновые антитела белки сыворотки крови, компоненты комплемента, антицитокиновые антитела, ревматоидный фактор Чувствительностьвысокаяочень высокая Точностьнизкая (CV может достигать 100%)высокая (CV в пределах 5-10%) Длительность1-4 днянесколько часов

8 МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СИСТЕМЫ ЦИТОКИНОВ СИНТЕЗ молекулярно-биологические – мРНК – планарные микрочипы иммунохимические – проточная цитометрия внутриклеточное содержание – иммуноцитохимический ПРОДУКЦИЯ иммунохимические – ИФА – проточная цитометрия концентрация (мультиплексный анализ) БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ биологические – хемотаксис – пролиферация – дегрануляция и т.д. СИНТЕЗ молекулярно-биологические – мРНК – планарные микрочипы ЭКСПРЕССИЯ иммунохимические – проточная цитометрия Рецепторы цитокинов Цитокины

9 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИТОКИНОВ (2) ПРОДУКЦИЯ IN VIVO СПОНТАННАЯ ПРОДУКЦИЯ IN VITRO (активация in vivo) ИНДУЦИРОВАННАЯ ПРОДУКЦИЯ IN VITRO – НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ (митогены, ЛПС) – СПЕЦИФИЧЕСКАЯ (аллергены, бактериальные антигены и т.д.)

10 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИТОКИНОВ (3) ПРОДУКЦИЯ IN VITRO ВЫДЕЛЕННЫЕ ФРАКЦИИ КЛЕТОК ЦЕЛЬНАЯ КРОВЬ ТКАНИ

11 Влияние тромбоцитов и плазмы на индукцию IL-8 в крови

12 100 классов = 100 тестов xMap технология xMap микросферы Проточный цитофлуориметр Проточная система и кювета Проточная система и кювета Двухлазерная компоновка Двухлазерная компоновка Детекция флюоресцентного сигнала Детекция флюоресцентного сигнала Карта микросфер (регионы) Каждый класс микросфер картируется –100 регионов

13 Приборы для х-МАР технологии Luminex-100 Luminex-200 MAGPIX Luminex FLEXMAP 3D

14 Анализ цитокинов Гемопоэтическая:IL-1β, IL-6, G-CSF, GM-CSF, IFNγ Аутоиммунная:IL-1β, IL-6, IL-12, TNFα Воспалительная:IL-6, IL-8, G-CSF, TNFα Th1/Th2:IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFNγ, TNFα 17-плексная:IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, IFNγ, TNFα, MCP-1, MIP-1 23-плексная:IL-1α, IL-2R, IL-3, IL-12(p40), IL-16, IL-18, CTACK, GRO-α, HGF, ICAM-1, M-CSF, IFN-α2, LIF, MCP-3, MIF, MIG, βNGF, SCF, SCGF-β, SDF-1α, TNF-β, TRAIL, VCAM-1 27-плексная:IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL- 12(p70), IL-13, IL-15, IL-17, Basic FGF, Eotaxin, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1 (MCAF), MIP-1α, MIP-1β, PDGF-BB, RANTES, TNFα, VEGF

15 Сравнительные характеристики ИФА и МИА методов определения цитокинов Сравниваемые параметры ИФАМИА ЧувствительностьВысокая: 10 пг/млВысокая: несколько пг/мл ОпределениеКоличественное СпецифичностьВысокая ВыявлениеБиологически активных и неактивных молекул Время проведения анализа Относительно небольшое (день)Более быстрый анализ (часы) Коэффициент вариации 5-10%10-15% Интерференцияотсутствует Протокол исследования Относительно простойпростой Объем образцаОтносительно большой ( мкл на 1 определение) Небольшой (50 мкл на все определения – до 100 параметров) Стимуляция детекции ОтсутствуетПрисутствует Срок хранения тест- системы НебольшойБолее продолжительный Разрешающая способность Определение 1 цитокина в одной биопробе Одновременное определение до 100 цитокинов в 1 биопробе

16 Биологический материал для определения концентрации цитокинов Периферическая кровь –сыворотка крови –плазма крови (ЭДТА) Биологические жидкости –цереброспинальная жидкость –секреты –смывы –моча и т.д. Экстракты тканей

17 ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОКИНОВ АКТИВАЦИЯ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА Th1 И Th2 МОНИТОРИНГ ВОСПАЛЕНИЯ

18 Уровни хемокинов в сыворотке крови больных системными васкулитами, Me [LQ; HQ] Хемокин, пг/млПрактически здоровые (n=20) Микроскопический полиангиит Гранулематоз Вегенера Синдром Черджа-Стросс (n=49) Узелковый полиартериит (n=36) CCL3/MIP-1α3,2 [3,0; 3,6] 4,1 [3,3; 5,2] 3,4 [2,7; 4,4] CCL4/MIP-1β11,0 [8,2; 13,3] 19,1 [16,6; 26,1] 15,6 [13,3; 19,9] CCL5/RANTES144,1 [142,5; 149,1] 150,3 [146,5; 153,5] 146,1 [144,1; 150,9] CCL11/Eotaxin7,7 [6,7; 10,0] 19,7 [15,6; 25,3] 17,9 [12,3; 26,8] CXCL8/IL-80,7 [0,5; 1,4] 1,9 [1,5; 2,8] 1,5 [1,2; 2,9]

19 Уровни мРНК хемокинов в крови больных системными васкулитами, Me [LQ; HQ] мРНК хемокинаПрактически здоровые (n=20) Микроскопический полиангиит Гранулематоз Вегенера Синдром Черджа-Стросс (n=49) Узелковый полиартериит (n=36) CCL3/MIP-1α9,7 [6,4; 12,8] 12,6 [7,2; 25,3] 16,8 [11,4; 26,4] CCL4/MIP-1β1,9 [0,6; 6,4] 0,7 [0; 1,9] 0,5 [0; 1,1] CCL5/RANTES5,2 [4,3; 9,4] 1,3 [0; 3,8] 1,0 [0; 4,5] CCL11/Eotaxin3,7 [2,2; 5,9] 1,9 [0,4; 3,6] 0,9 [0; 2,4] CXCL8/IL-81,3 [1,1; 1,6] 0,6 [0; 1,3] 0,8 [0; 1,3]

20 УРОВЕНЬ IL-8 (пкг/мл) ПРИ ОСТРОМ ГНОЙНОМ ГАЙМОРИТЕ

21 Уровень цитокинов IL-1β, IL-6, IFN-γ, G-CSF (пг/мл) в сыворотке крови больных СКВ ** *** 21

22 Уровень IL-1ß, IL-6, IFN-γ (пг/мл) в сыворотке крови больных СКВ с негативными и позитивными значениями АНФ, антител к дсДНК, антител к КЛ IgG/IgM * IL-6 IFN-γ * IL-1β * Условные обозначения: 1 - АНФ - антитела обнаружены 2 - антитела к дсДНК IgG - антитела не обнаружены 3 - антитела к кардиолипину IgG/IgM *p

23 Вклад клинических критериев и лабораторных показателей в диагностику СКВ (n=105) * больные СКВ в сыворотке которых была измерена концентрация цитокинов (n=61) ** больные ДКВ и СКВ которым был выполнен ТВП (n=15) 23

24 Псориаз

25 Цитокины, пг/мл Практически здоровые (n=10) Me (min-max) Больные псориазом с индексом PASI (n=10): PASI< 10 Me (min- max) PASI>20 Me (min-max) Провоспалительные цитокины IL-1α0 (0 – 0)0 (0 – 0,65)0 (0 – 0) IL-1β0,1 (0 – 0,95)0,5 (0,37 – 1,18)0,4 (0,21 – 0,55) IL-12 (p40)0 (0 – 0)1,7 (0,59 – 3,15) *3,4 (1,12 – 5,97) * IL-12(p70)3,5 (0 – 5,04)1,33 (0 – 2)0,1 (0 – 1,68) IL-161,7 (0 – 2,17)2,5 (1,79 – 3,32)2,4 (2,08 – 2,9) IL-170 (0 – 0) IL-1861,4 (0 – 176,6)159 (118,2 – 229,5) 173,3 (140,5 – 195,6) TRAIL79 (0 – 196,1)125,8 (107,9 – 137,9)109,9 (81,2 – 176,3) Противовоспалительные цитокины IL-100 (0 – 3,43)0,7 (0,02 – 1,04)0 (0 – 0,82) IL-1RA0 (0 – 207,3)61,1 (0 – 328,5)55,4 (0 – 122,2) Th1-цитокиныIL-2Rα 20,6 (17,7 – 25,1) 52,9 (42,0 – 69,7) *63,4 (46,6 – 87,8) * IFNα-24,3 (0 – 20,1) 36,2 (32,6 – 47,7) * 38,0 (33,5 – 51,5) * IFN-γ1,3 (0 – 48,9)17,0 (12,4 – 32,9)5,4 (2,71 – 12) Th2-цитокины IL-50,01 (0 – 2,38)1,1 (0,03 – 1,49)0,3 (0,14 – 0,65) IL-90 (0 – 8,85)88,6 (4,6 – 442,5)22,5 (0 – 518) IL-130,5 (0 – 14,41)36,7 (8,0 – 53,8)5,3 (1,2 – 33,6) LIF0 (0 – 0,16)35,8 (0 – 55,7)24,2 (0 – 56,8)

26 Содержание цитокинов (пг/мл) в сыворотке крови больных псориазом, групп сравнения и практически здоровых лиц достоверность различий показателя по сравнению с практически здоровыми лицами, при p

27 Содержание IL-2, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFN-γ и TNF-α (пг/мл) в сыворотке крови больных псориазом в зависимости от индекса PASI достоверность различий показателя по сравнению с практически здоровыми лицами, при p

28 Содержание цитокинов (пг/мл) в моче больных псориазом, групп сравнения и практически здоровых лиц - достоверность различий показателя по сравнению с практически здоровыми лицами, при p

29 Содержание IL-8, IL-10, GM-CSF, IFN-γ и TNF-α (пг/мл) в моче больных псориазом в зависимости от индекса PASI достоверность различий показателя по сравнению с практически здоровыми лицами, при p

30 Корреляционные зависимости между содержанием некоторых цитокинов от клинических и лабораторных показателей Взаимосвязь между уровнем IL-6 (r=0,4, p

31 ЭКСПРЕССИЯ ХЕМОКИНОВ И ИХ РЕЦЕПТОРОВ В БИОПТАТАХ ВИЗУАЛЬНО ЗДОРОВОЙ И ПОРАЖЕННОЙ КОЖИ ПРИ ПСОРИАЗЕ * * * * * * * * * - достоверные отличия по сравнению с контролем при p

32 Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов в визуально здоровой коже пациентов псориазом и склеродермией * * * * * * * Достоверные отличия от практически здоровых при p

33 Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов в визуально здоровой коже пациентов псориазом * * ** * Достоверные отличия от практически здоровых при p

34 Экспрессия внутрипеченочной MCP-1 при ХГС ИГА печени фиброз печени F1 – слабый фиброз F2 – умеренный фиброз F3 – тяжелый фиброз F1 F2 F3

35

36 Средние значения уровней цитокинов в ларингеальном секрете больных папилломатозом и здоровых лиц

37 после лечения до лечения Эндоскопическая картина гортани пациента с респираторным папилломатозом до и после курса ингаляционной интерфероновой терапии

38 Исходные уровни TNFα в ларингеальном секрете больных папилломатозом в зависимости от результата лечения * – различия между группами больных достоверны при р

39 Динамика уровней цитокинов в ларингеальном секрете больных с частичным и полным регрессом папиллом в результате лечения * – различия с исходными значениями достоверны при р

40 Выбор цитокина или комбинации цитокинов, методов их определения и биоматериала должно быть обусловлено исключительно задачами исследования

41 Большой АраратБольшой Арарат (тень)

42 БЛАГОДАРНОСТИ СКВ, васкулиты Мазуров В.И., Маслянский А.Л., Долгих С.В. ЛОР-патология Плужников М.С., Катинас Е.Б. МАПО, Ленинградская областная больница Кафедра ЛОР-болезней СПб ГМУ Гепатит С Лобзин Ю.В., Жданов К.В., Гусев Д.А., Чирский В.С., Шахманов Д.М. Кафедра инфекционных болезней Военно- медицинской академии имени С.М.Кирова Псориаз Манахов К.Н., Хобейш М.М. Шемеровская Т.Г., Ильина Т.Н. Кафедра дерматовенерологии СПб ГМУ им.акад.И.П.Павлова Санкт-Петербургский городской ревматологический Центр (ГБ 25) Чухловин А.Б., Сысоев К.А., Лапин С.В., Мазинг А.В., Бельтюкова А.С. НМЦ по молекулярной медицине СПб ГМУ им.акад.И.П.Павлова