Поиск диагностических морфологических признаков и генетических маркеров у ели европейской (Picea abies) и ели сибирской (P. obovata) и определение видовой. - презентация

1 Поиск диагностических морфологических признаков и генетических маркеров у ели европейской (Picea abies) и ели сибирской (P. obovata) и определение видовой принадлежности елей Северной Карелии Борисова П. Научныe руководители: Волкова П.А. Волкова П.А. Ильинский В.В.

2 Введение P. abies P. obovata Зона гибридизации

3 P. abies P. obovata Зона гибридизации ледник

4 Цель поиск видоспецифичных морфологических диагностических признаков и генетических маркеров у поиск видоспецифичных морфологических диагностических признаков и генетических маркеров у P. abies и P. obovata и определение видовой принадлежности елей Северной Карелии. P. abies и P. obovata и определение видовой принадлежности елей Северной Карелии.

5 Материалы и методы 141 дерево (149 шишек), 10 популяций Германия (3) Северная Карелия (4) Ненецкий АО (1) Красноярский край (2)

6 Наша работа

7 Морфология P. obovata P. abies Длина шишек: см 4-6 (8) см

8 коэффициент сужения: DSL/HS*100 коэффициент вытянутости: (LS-DS)/HS*100 значение разности коэффициентов сужения и вытянутости: – 55 P. abiesP. obovata

9 Геометрическая морфометрия – описание формы без размеров объекта

10 Классическая морфометрия Длина шишки, наибольшая ее ширина и расстояние до нее от основания шишки; для чешуи – аналогично Длина шишки, наибольшая ее ширина и расстояние до нее от основания шишки; для чешуи – аналогично Вторичные показатели: отношение длины к ширине и отношение положения наибольшей ширины к длине для чешуи и шишки Вторичные показатели: отношение длины к ширине и отношение положения наибольшей ширины к длине для чешуи и шишки коэффициенты сужения и вытянутости и их разность коэффициенты сужения и вытянутости и их разность

11 Геометрическая морфометрия

12 Распределение исследованных образцов в пространстве двух первых главных компонент (классификация по совокупности морфологических промеров) ь

13 Длина шишек для популяций P. abiesP. obovataС. Карелия

14 Отношение длины шишки к ее ширине С. КарелияP. obovataP. abies

15 Разность коэффициентов сужения и вытянутости С. КарелияP. obovataP. abies

16 Распределение исследованных растений в пространстве двух первых главных компонент для результатов геометрической морфометрии

17 Усредненные контуры чешуй

18 Постепенный переход P. abiesP. obovata изменение частот аллелей некоторых генов с запада на восток Маркеры в хлоропластной и митохондриальной ДНК Разграничивают виды, но важны частоты маркеров в популяции => нужны большие выборки полиморфизм одиночных нуклеотидных замен (Single nucleotide polymorphism, SNP) Возможно использовать для различения видов Молекулярно-генетическая часть

19 Материалы и методы Поиск нужных участков ДНК (по базе данных) Подбор праймеров Выделение ДНК Получение копий этих участков (ПЦР) Электрофорез определение последовательности нуклеотидов

20 Выбранные последовательности ДНК (в скобках – условные названия) 4 участка ДНК – два ядерных (220 и 467), два ядерных (220 и 467), один митохондриальный (МТ) один митохондриальный (МТ) один хлоропластный (TRN) один хлоропластный (TRN) Результаты и обсуждение

21 Подбор параметров ПЦР 58°, 10 сек 60°, 10 сек 62°,10 сек 61°, 10 сек 64°, 5 сек 65°, 5 сек 67°, 5 сек 60°, 5 сек

22 Полученные последовательности SNP в 427 позиции для участка для хлоропластного участка. GB – последовательности GenBank GB – последовательности GenBank видP. abies (GB) P. obovata (GB) P. abiesP. obovataКарельские ели нуклеотид СACAA

23 SNP для ядерного участка (220) GB – последовательности GenBank

24 Выводы Найден участок хлоропластной ДНК, который можно рекомендовать для дальнейшей разработки маркера для разграничения P. abies и P. obovata. Разработаны праймеры и подобраны оптимальные параметры ПЦР для анализа SNP на этом участке. Найден участок хлоропластной ДНК, который можно рекомендовать для дальнейшей разработки маркера для разграничения P. abies и P. obovata. Разработаны праймеры и подобраны оптимальные параметры ПЦР для анализа SNP на этом участке. P. abies, P. obovata различаются длинной шишек и формой чешуи, описанной как классической, так и геометрической морфометрией. P. abies, P. obovata различаются длинной шишек и формой чешуи, описанной как классической, так и геометрической морфометрией. Карельские ели, согласно данным геометрической морфометрии, относятся к P. × fennica, согласно классической морфометрии – к P. obovata. Карельские ели, согласно данным геометрической морфометрии, относятся к P. × fennica, согласно классической морфометрии – к P. obovata.

25 Благодарности Часть материала для настоящей работы собрана в ходе Беломорской экспедиции Московской гимназии на Юго-Западе (1543). собрана в ходе Беломорской экспедиции Московской гимназии на Юго-Западе (1543). Автор благодарит научных руководителей Волкову Полину Андреевну и Ильинского Валерия Владимировича; Л. Абрамову, П. Волкову, П. Петрова, А. Еськову, Е.Трушину, К. Трушина за помощь в сборе материала. Д.В. Ребрикова за ценные указания и помощь в написании работы, а так же коллектив ЦКП Д.В. Ребрикова за ценные указания и помощь в написании работы, а так же коллектив ЦКП «Генный полиморфизм» за предоставленную возможность проведения работы. Также автор признателен рецензенту Д. Кнорре за ценные замечания о данной работе и С. М. Глаголеву за организацию практики.

26 Спасибо за внимание

27 Геометрическая морфометрия Метод тонких пластин Метод тонких пластин 20 равноудаленных точек по всему контуру 20 равноудаленных точек по всему контуру Координаты меток – экранный дигитайзера tpsDig Координаты меток – экранный дигитайзера tpsDig Координаты эталонной конфигурации, значения главных, относительных и частных трансформаций – программа tpsRelw Координаты эталонной конфигурации, значения главных, относительных и частных трансформаций – программа tpsRelw Усредненные контуры чешуй – программа tpsSuper Усредненные контуры чешуй – программа tpsSuper Редактирование и конвертирование файлов данных – вспомогательная программа tpsUtil Редактирование и конвертирование файлов данных – вспомогательная программа tpsUtil

28 биостанция Чупа Расположение карельских популяций губа Чупа Кандалакшского залива Белого моря

29 Анализ главных компонент Анализ главных компонент Однофакторный дисперсионный анализ с последущим попарным сравнением выборок тестом Вилкоксона с поправкой Бонферрони. Однофакторный дисперсионный анализ с последущим попарным сравнением выборок тестом Вилкоксона с поправкой Бонферрони. Использовали статистическую среду R Использовали статистическую среду R

30 Вид попул я ц и и LCLC/HCDC/LCLS/HSDS/LSCPCNCN – CP Карелия b 62±111.92± ± ± ±0.0543±753±1110±14 c 58±101.94± ± ± ±0.0645±1156±1410±17 d 65±122.20± ± ± ±0.0543±958±1515±21 e 57±92.01± ± ± ±0.0545±859±1315±15 P. obovata f 57±92.04± ± ± ±0.0650±1371±821±19 g 61±82.17± ± ± ±0.0837±1173±835±12 h 68±41.99± ± ± ±0.0846±1262±616±14 P. abies i 118±132.78± ± ± ±0.0554±2037±8-14±13 j 110±182.50± ± ± ±0.0653±1043±3-10±11 k 105±103.09± ± ± ±0.0252±340±9-12±6

31 значения коэффициента вытянутости (CP)

32 коэффициент сужения (CN )

33 Отношение положения наибольшей ширины чешуи к ее длине (DC/LC)

34 Геометрическая морфометрия

35

36 Выделение ДНК ДНК выделяли из высушенной хвои используя метод СТАВ. К хвоинкам добавляли 500 мкл лизирующего буфера (0,2 М Tris-HCl pH 8,0, 0,05М EDTA, 2М NaCl, 2% СТАВ), образец вместе с буфером гомогенизировали в фарфоровой ступке. После проводили очистку ДНК с помощью стандартной методики фенол-хлороформной экстракции (Chomczynski, Sacchi, 1987): ДНК выделяли из высушенной хвои используя метод СТАВ. К хвоинкам добавляли 500 мкл лизирующего буфера (0,2 М Tris-HCl pH 8,0, 0,05М EDTA, 2М NaCl, 2% СТАВ), образец вместе с буфером гомогенизировали в фарфоровой ступке. После проводили очистку ДНК с помощью стандартной методики фенол-хлороформной экстракции (Chomczynski, Sacchi, 1987): Добавляли 400 мкл фенола pH=7,2, хорошо перемешивали. Добавляли 400 мкл фенола pH=7,2, хорошо перемешивали. Добавляли 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1), хорошо перемешивали. Добавляли 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1), хорошо перемешивали. Центрифугировали 10 мин при об/мин (16000 g). Центрифугировали 10 мин при об/мин (16000 g). Переносили водную фазу в новую пробирку 1,5мл и добавляли в нее 800 мкл 100% изопропанола, хорошо перемешивали. Переносили водную фазу в новую пробирку 1,5мл и добавляли в нее 800 мкл 100% изопропанола, хорошо перемешивали. Центрифугировали 5 мин при об/мин. Центрифугировали 5 мин при об/мин. Полностью удаляли надосадочную жидкость. Полностью удаляли надосадочную жидкость. Добавляли 400 мкл 70% этанола, хорошо перемешивали. Добавляли 400 мкл 70% этанола, хорошо перемешивали. Центрифугировали 5 мин при об/мин Центрифугировали 5 мин при об/мин Полностью удаляли надосадочную жидкость и высушивали осадок при комнатной температуре (не более 10 мин). Полностью удаляли надосадочную жидкость и высушивали осадок при комнатной температуре (не более 10 мин). Растворяли осадок в 50 мкл TE (Tris EDTA) буфера путем инкубирования при 65° С с периодическим перемешиванием. Растворяли осадок в 50 мкл TE (Tris EDTA) буфера путем инкубирования при 65° С с периодическим перемешиванием. В дальнейшем образцы хранили при температуре – 20° С. В дальнейшем образцы хранили при температуре – 20° С.

37 Общий объем смеси для ПЦР на одну пробирку составлял 25 мкл 17,5 мкл воды 17,5 мкл воды 2,5 мкл 10-ти кратного ПЦР-буфера 2,5 мкл 10-ти кратного ПЦР-буфера 0,5 мкл раствора dNTP's (25мМ каждого) – дезоксинуклеотидтрифосфатов 0,5 мкл раствора dNTP's (25мМ каждого) – дезоксинуклеотидтрифосфатов 0,15 мкл каждого праймера 0,15 мкл каждого праймера 1 мкл ДНК 1 мкл ДНК 0,5 мкл HS Taq-полимеразы (ЗАО «Евроген») 0,5 мкл HS Taq-полимеразы (ЗАО «Евроген»)

38 Выбранные видоспецефичные последовательности ДНК Результаты и обсуждения Название участка Участок Номера в GenBank 1 – P. abies 2 – P. obovata Праймеры/название праймера 467 conserved ortholog set (COS) PgTRX_WS00935.B21_B17 1. EU EU GTCAAGCAGGCCACGTGGGTC (467-D) AGTTGGAGGACCTAGGGAGGAG (467-R) 220 conserved ortholog set (COS) PgTRX_ EU EU GCTTGCTAAGAGTGGAACCTGTTC (220-D) ACGACTTGTTATGCACTGGGCTTG (220-R) TRN isolate ABI2b tRNA-Thr (trnT) gene, partial sequence; tRNA-Leu (trnL) gene, complete sequence; and tRNA-Phe (trnF) gene 1. EU EF TGAATGTAGATTGTAGATTCCTTCAAG (TRN-D) GTCCGTAGCGTCTACCGATTTCG (TRN-R) MT NADH dehydrogenase subunit 1 (nad1) gene, intron 2 and partial cds 1. EF EF TCTATAGATAGAGAGATAGTAGCGAG (MT-D) CTCAAAGGGCTAGCTAGAAGGTAAG (MT-R)