Скачать презентацию
Идет загрузка презентации. Пожалуйста, подождите
Презентация была опубликована 11 лет назад пользователемwww.pynny.ru
1 МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ В ПРОТЕОМНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ Марина Васильевна Серебрякова Лаборатория протеомного анализа ФГУ НИИ ФХМ г.Москва Часть 2: Приложения
2 1) определение количества того или иного белка в образце; 2) идентификация белка; 3) уточнение первичной структуры; 4) определение пост-трансляционных модификаций. 2D-электрофорез Специфический гидролиз MALDI-MS Специфический гидролиз Хроматография ESI-MS-MS, микросеквенирование ПРОТЕОМИКА – набор высокотехнологичных методов изучения белков Белковые чипы
3 Масс-спектрометрия целых белков Точность недостижима при использовании времяпролетной масс- спектрометрии, ионных ловушек Изучаемый белок как правило отличен от имеющегося в базе данных Для идентификации белка по его молекулярной массе необходима точность ее измерения < 2ppm Такая точность доступна при использовании масс-спектрометрии ИЦР В базе данных NCBI nr более записей Пример: при анализе всех цитозольных белков бактерии Rhodobacter с использованием масс-спектрометрии ИЦР идентифицировано около 10% белков, пики которых наблюдались в спектре. Массы остальных белков были отличны от рассчитанных по гену из-за наличия пост-трансляционных модификаций.
4 Профилирование белков КОНТРОЛЬНАЯ СЫВОРОТКА РАК МАТКИ РАК ЯИЧНИКОВ Подложки с разными типами поверхности: обращенная фаза, анионообменная, катионообменная. Биомаркер рака яичников Для идентификации белков отличий необходимо их выделение. Детектируются, как правило, хорошо представленные белки. В данном случае – сывороточный амилоид А1
5 2D электрофорез белков Компьютерный анализ изображений гелей Вырезание и трипсинолиз белков в фрагментах геля Экстракция пептидов и получение MALDI масс-спектра суммарного гидролизата Поиск в базе данных измеренных масс пептидов (пептидный фингерпринт) Post Source Decay-MS, TOF-TOF фрагментация отдельных пептидов Поиск в базе данных измеренных масс фрагментов Стратегия анализа: 2DE + MALDI-MS
6 2D-Электрофорез Электорофорез по Лэмли: Добавляется додецилсульфат Na: сильный детергент вносит отрицательный заряд Эффективное разделение по массам белков кДа Первое направление – изоэлектрическая фокусировка Второе направление – разделение по массам в полиакриламидном геле Белки, растворенные в неионном детергенте, вносятся в гель с фиксированным градиентом рН
7 2D-Электрофорез pI Mw kDa 8 Достоинства Реальные параметры разделения Эффективное разделение Полуколичественный метод Ограничения Проблемы с кислыми, щелочными и гидрофобными белками Невысокая воспроизводимость Окраска: Чувствительность: Кумасси голубым 50 нг/пятно Серебром, совместимая с MS анализом 1 нг/пятно Серебром, классическая 0.1 нг/пятно
8 2D-Электрофорез Окраска DIGE Cy3/Cy5 Электрофорез 2-х предварительно окрашенных белков Mycoplasma gallisepticum проводится на одном геле. Зеленым (Cy3) – белки из контрольных клеток, Красным (Cy5) – белки из обработанных клеток. Достоинства: Очень чувствителен, прекрасное сопоставление пятен, очень точен и удобен для оценки экспрессии белка Недостатки: Недолговечность флуоресценции (сутки), требует дорогих сканеров, непригоден для вырезания пятен без дополнительной окраски серебром
9 ограничение поиска по видовой принадлежности выбор базы данных учет возможных модификаций пептидов точность измеренных масс список масс пептидных фрагментов Вырезание отдельных белковых пятен (>20 нг/мм 2 ) Трипсинолиз белков в фрагментах геля Получение масс-спектра Схема проведения идентификации белка по его пептидному фингерпринту количество кандидатов
10 Триптические пептиды Да точность (%) кол-во кандидатов 0.1 > Немного статистики: Среднее количество пептидов разной длины, образующихся в результате полного гидролиза Распределение моноизотопных масс пептидов «уникальные» В базе данных NCBI nr более записей
11 Критерии достоверности поиска белков в базах данных: peptide fingerprint 1.количество «совпавших» пептидов, в предположении одного белка 2.количество «совпавших» пептидов, в предположении нескольких белков 3.распределение «совпавших» пептидов по точности 4.«уникальность» пептидов 5.перекрывание «совпавшими» пептидами последовательности белка 6.паттерны протеолиза 7.oтклонение массы белка от предполагаемой и т. д. измеренные m/z база данных Приоритет критериев 2, 4, 7 программа Profound Приоритет критериев 1, 5, 6 программа Mascot Score
12 N Масса Вероятность Описание 1.gi| reading frame [Influenza A virus] 2.gi| M1 [influenza A virus (A/Taiwan/96/1769)] 3.gi| M1 subunit [Influenza A virus] 4.gi| M1 - influenza A virus (strain A/WSN/33) gi| M1 [Influenza A virus (A/Duck/Hong Kong/698/79 (H5N3))] Sequence Coverage: 35% IVPSGPLKAE IAQRLEDVFA GKNTDLEVLM EWLKTRPILS PLTKGILGFV FTLTVPSERG LQRRRFVQNA LNGNGDPNNM DKAVKLYRKL KREITFHGAK EIALSYSAGA LASCMGLIYN RMGTVTTEVA FGLVCATCEQ IADSQHRSHR QMVTTTNPLI RHENRMVLAS TTAKAMEQMA GSSEQAAEAM DIASQARQMV QAMRTIGTHH SSSAGLKDDL LENLQAYQKR MGVQMQRFK 20 кандидатов в порядке убывания достоверности поиска массы 20 кандидатов вероятность случайное совпадение достоверный поиск Идентификация белка заменяется нахождением его ближайшего гомолога Изучаемый белок обычно отличен от имеющегося в базе данных
13 Accession Mass Score Description 1. gi| CYTOCHROME P450 2E1 2. gi| // gi| // gi| DIMETHYLANILINE MONOOXYGENASE 5. gi| // gi| // gi| // gi| CYTOCHROME P-450 IIC 9. gi| // gi| // gi| //---- …………………… 18. gi| NEBULIN Cпектр гидролизата смеси белков (1DE)
14 2DE + MALDI-MS - результаты Белковых пятен > 400 Проанализировано >150 Индивидуальных белков Mycoplasma gallisepticum 105 MW pI Mycoplasma gallisepticum strain R Protein coding genes - 726
15 pI pI А АБ АБ Б pI DЕ карты белков клеточной линии аденокарциномы молочной железы MCF7: контрольной (А) и устойчивой к Hoechst33342 (Б) 2DE карты белков штамма клеток E.coli (А) и штамма-продуцента треонина (Б) 2DE карты клеточных белков двух штаммов Helicobacter pylori Всего видно на геле ~1200 белковых пятен Видимых различий ~ 50 Идентифицировано ~ 30 белков отличия Всего видно на геле ~ 500 белковых пятен Видимых различий ~ 200 Идентифицировано ~ 150 разных белков Из них белки отличия ~ 100 Всего видно на геле ~ 2500 белковых пятен Видимых различий ~ 30 Идентифицировано ~ 10 белков отличия Примеры анализа 2DE карт
16 Стратегия анализа: 1D - LC + ESI-MS/MS Получение масс-спектров пептидов и их фрагментации Объединение данных и анализ 1D электрофорез белков Вырезание и трипсинолиз белков в полосах геля Экстракция и хроматографическое разделение пептидов
17 Способы фрагментации пептидов LID – фрагментация, индуцированная лазером CID – фрагментация, индуцированная столкновениями ECD – фрагментация, индуцированная захватом медленных электронов Пептид поглощает энергию лазера, захваченная энергия перераспределяется по молекуле, разрушается ближайшая слабая связь. Основной тип образовавшихся пептидных фрагментов - b-ионы и y-ионы. Может происходить отщепление модификаций. Пептид приобретает энергию от столкновений, захваченная энергия перераспределяется по молекуле, разрушается ближайшая слабая связь. Основной тип образовавшихся пептидных фрагментов - b-ионы и y-ионы. Дополнительно образуются a-ионы и x-ионы. Часто происходит отщепление модификаций. Точный механизм неизвестен. Пептид захватывает медленные электроны на азот пептидной связи, происходит мгновенный разрыв пептидной цепи с образованием z- ионов. Не происходит отщепления модификаций.
18 Интерпретация спектров распада пептидов TIGTHPSSSAGLK [MH] 2+
19 1.Отбор из базы данных всех кандидатов, содержащих триптические пептиды указанных m/z 2. «Примерка» спектров фрагментации (MS/MS) : количество «совпавших» фрагментов пептидов «уникальность» спектров фрагментации пептидов 3. Score белка = Score пептидов измеренные m/z база данных Score Критерии достоверности поиска белков в базах данных: peptide fingerprint + MS/MS Score пептидов
20 1DE + LC-ESI-MS/MS - результаты Проведено 3 эксперимента Белковых полос - 50 Индивидуальных белков Mycoplasma gallisepticum Эксп.1 Эксп.2 Эксп.3 Белки, которые обнаружены хотя бы в 1 эксперименте Белки, которые обнаружены хотя бы в 2 экспериментах Белки, которые обнаружены во всех 3 экспериментах ? MW Белки, которые обнаружены при проведении 2DE+MALDI-MS - 90 Mycoplasma gallisepticum strain R
21 СОПОСТАВЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ: 2DE + MALDI-MS и 1DE + LC-ESI-MS/MS Protein NCBI mW score conserved hypothetical lipoprotein gi| conserved hypothetical lipoprotein gi| conserved hypothetical lipoprotein gi| conserved hypothetical lipoprotein gi| conserved hypothetical lipoprotein gi| Protein NCBI mW score conserved hypothetical lipoprotein gi| conserved hypothetical lipoprotein gi| HepA/SNF gi| conserved hypothetical lipoprotein gi| conserved hypothetical lipoprotein gi| lipoprotein gi| lipoprotein gi| lipoprotein gi| conserved hypothetical lipoprotein gi|
22 Стратегия анализа: LC + ESI-MS/MS Специфический гидролиз суммарного белка + мечение ICAT Хроматографическое разделение пептидов + MS/MS Достоинства: Анализируются все меченные белки Анализ содержания одного белка в контроле и опыте Ограничения: Не видно взаимных количеств разных белков в образце Артефакты в интерпретации MS/MS Пример: ICAT-метки Выделение цистеинсодержащих пептидов (афинное связывание с авидином)
23 Интерпретация спектров распада пептидов (LID +CID) Сиквенирование de-novo: определение пар пиков, в сумме дающих массу родительского иона по наличию соседних пиков +/-28, +/-15 определение типа ионов по разнице масс соседних однотипных ионов построение возможных последовательностей
24 Лабильность пептидной связи убывает в ряду D/P D/ E/ N/ Q/ l/ L/ T/ S/ A/ V/… Степень фрагментации зависит от многих параметров и плохо предсказуема. Ограничения cиквенирования de-novo при использовании MALDI-TOF-MS : * не бывает равномерного разбиения по всем пептидным связям * не хватает точности измерения для однозначной интерпретации MALDI фрагментация пептидов (LID +CID)
25 Определение пост-трансляционных модификаций белков Модификации in vitro: Модификации белков после их разделения в ПААГ цистеины алкилированы йодоацетамидом (в геле) Лизоцим Т11 Т9 Т6 Т13 Т13-14 Cys + I ацетамид Cys + акриламид Met окислен Модификации in vivo: Изучение S-S мостов
26 О-гликозилированный пептид SAPASTTQPIGSTTSTTTK сахарный остаток галактоза (верх) либо фукоза (низ) Сахарный остаток локализован на N-концевом серине ? Стабильность различных модификаций белков в условиях получения масс-спектров (LID + CID) Pi N-ac Фрагмент спектра трипсинолиза природного (верх) и генно-инженерного (низ) белка Такова степень фосфорилирования ? Связи менее устойчивые, чем пептидная: фосфоэфирная гликозидная дисульфидная (иногда)
27 Стабильность различных модификаций белков в условиях получения масс-спектров (LID + CID) Связи сопоставимые по устойчивости с пептидной: тиоэфирная любая амидная - N-ацетилирование дисульфидная (иногда) Пептид, модифицированный тремя пальмитатами (тиоэфирная связь) Пептид N- ацетилирован, а цистеин модифицирован янтарным ангидридом (тиоэфирная связь)
28 Сравнение подходов при определении белкового состава сложной многокомпонентной смеси Выделение белка Гидролиз специфическими протеазами - соотнесение значений масс пиков в спектре с первичной структурой. Определение пептидов отличных по массе от рассчитанной – гипотезы о природе модификации Индивидуальный подход к получению структурной информации из спектров фрагментации – выбор типа фрагментации, использование ферментов для дальнейшего расщепления пептида, удаления модификации, химические подходы... Стратегия определения модификаций:
29 Литература: * Говорун В.М., Арчаков А.И. Протеомные технологии в современной биомедицинской науке. Biochemistry (Mosc) Oct;67(10): * Lottspeich F. Proteome Analysis: A Pathway to the Functional Analysis of Proteins. Angew Chem Int Ed Engl Sep;38(17): * M.Mann, R.C.Hendrickson, A.Pandey, Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry, Annu. Rev. Biochem., 70, (2001). * O.N.Jensen, M.Wilm, A.Shevchenko, M.Mann, Sample preparation methods for mass spectrometric peptide mapping directly from 2-DE gels, Methods Mol. Biol., 112, (1999). * B.Kuster, T.N.Krogh, E.Mortz, D.J.Harvey, Glycosylation analysis of gel-separated proteins, Proteomics, 1, (2001). * Aebersold R, Goodlett DR Mass spectrometry in proteomics Chem Rev 2001 Feb;101(2): * Nordhoff E, Egelhofer V, Giavalisco P, Eickhoff H, Horn M, Przewieslik T, Theiss D, Schneider U, Lehrach H, Gobom J. Large-gel two-dimensional electrophoresis-matrix assisted laser desorption/ionization-time flight-mass spectrometry: an analytical challenge for studying complex protein mixtures. Electrophoresis Aug;22(14): * Roepstorff P MALDI-TOF mass spectrometry in protein chemistry.. EXS 2000;88:81-97 * Gygi SP, Aebersold R. Using mass-spectrometry for quantitative proteomics Proteomics: A Trands Guide 2000, * Andersen JS, Mann M Functional genomics by mass spectrometry. FEBS Lett Aug 25;480(1):25-31 * Kussmann M, Roepstorff P Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS. Methods Mol Biol. 2000;146: * Chaurand P, Luetzenkirchen F, Spengler B. Peptide and protein identification by matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) and MALDI-post-source decay time-of-flight mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom Feb;10(2): * Spengler, B, Post-source decay analysis in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biomolecules. J. Mass Spectrom., 32(10) (1997). * Jonscher, KR and Yates, JR, 3rd, The quadrupole ion trap mass spectrometer--a small solution to a big challenge. Anal Biochem, 244(1) 1-15 (1997). * Qin, J and Chait, BT, Identification and characterization of posttranslational modifications of proteins by MALDI ion trap mass spectrometry. Anal Chem, 69(19) (1997). * Papayannopoulos, IA, The interpretation of collision-induced dissociation tandem mass spectra of peptides. Mass Spectrom. Rev., 14(1) (1995). * Hillenkamp, F, Karas, M, Beavis, RC and Chait, BT, Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Anal. Chem., 63(24) 1193A-203A (1991). * Fenn, JB, Mann, M, Meng, CK, Wong, SF and Whitehouse, CM, Electrospray ionization-principles and practice. Mass Spectrom. Rev., 9(1) (1990)
Еще похожие презентации в нашем архиве:
© 2024 MyShared Inc.
All rights reserved.