Набор реагентов для исследования биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР в режиме реального времени Фемофлор. ЗАО «НПФ ДНК-Технология» 2009. - презентация

1 Набор реагентов для исследования биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР в режиме реального времени Фемофлор. ЗАО «НПФ ДНК-Технология» 2009 г.

2 ПЦР - это ДНК-Технология214 октября 2012 г. Введение До недавнего времени существовали значительные ограничения в изучении микробиологических сообществ. Главные из них: недостаточная дискриминация микроорганизмов по морфологическим признакам; cложности в культивировании большинства микроорганизмов. Внедрение молекулярно-биологических методов позволило открыть большое число новых микроорганизмов, расширить, упорядочить, а в некоторых случаях пересмотреть знания о таксономии. По современным оценкам более 90% микроорганизмов окружающей среды ранее не могли быть культивированы и идентифицированы. В случае биоценоза кишечника эта цифра составляет более 60%. Вагинальный биоценоз представляет собой сложную сбалансированную систему. Учитывая его влияние на протекание и исход беременности и на инфицированность верхнего урогенитального тракта, изучение вагинального биоценоза, его состава и принципы регуляции и восстановления в норме и при патологиях представляет собой крайне важную задачу.

3 ПЦР - это ДНК-Технология314 октября 2012 г. Вагинальная экосистема (биоценоз) У здоровых женщин вагинальная экосистема хорошо сбалансирована и стабильна. В 1 мл вагинальной жидкости в среднем содержится около 10 9 бактерий (CFU - колоний образующих единиц). В норме основным компонентом вагинального биоценоза являются лактобактерии. Они участвуют в метаболизме гликогена, который эксклюзивно вырабатывается клетками вагинального эпителия, превращая его в молочную кислоту и приводя к закислению – в норме pH 3,8 – 4,5. Кислый pH в сочетании с выработкой бактериоцина (bacteriocin) и перекиси водорода создает защиту, препятствующую колонизации урогенитального тракта женщин другими микроорганизмами. Кроме лактобактерий в норме могут присутствовать другие микроорганизмы, например Staphylococci, group B Streptococci, Corynebacterium, Prevotella, Peptostreptococcus, Gardnerella, Enteric bacteria и другие, причём похоже, что существуют их устойчивые сочетания. В норме количество этих микроорганизмов составляет около CFU/ml.

4 ПЦР - это ДНК-Технология414 октября 2012 г. Нарушения вагинального биоценоза Нарушения вагинального биоценоза связаны с вагинитами и вагинозами. Устойчивость биоценоза к воздействиям обусловлены: генетическими факторами связанными с функционированием иммунной системы, прежде всего врожденного иммунитета; составом биоценоза (вагинальной микрофлоры); внешние факторы (LifeStyle)

5 ПЦР - это ДНК-Технология514 октября 2012 г. Баквагиноз причина Причина возникновения не ясна. Считается, что из-за снижения количества лактобактерий, но почему оно снижается? При снижении количества лактобактерий возникает «замкнутый круг»: Снижение кол-ва лактобактерий Уменьшение продукции H 2 O 2 Рост ассоциированных с баквагинозом бактерий Повышение pH

6 ПЦР - это ДНК-Технология614 октября 2012 г. Баквагиноз лечение До 80-х преобладало мнение, что баквагиноз не болезнь, а «неприятность» и в большинстве случаев специфическое лечение не назначалось. С 80-х из-за различных осложнений «на всякий случай» стали лечить антибиотиками против анаэробов – metranidazole и clinamycine (рекомендованы Центром Контроля Болезней, CDC). Стандартное лечение метранидазолом и клинамицином в течение недели помогает в 80-90% случаев. Однако, в течение трех месяцев в 15-30% случаев рецидивирует, так называемый рецидивирующий баквагиноз. Проблема не в том, как убрать «плохие» бактерии, а в том как восстановить нормальный биоценоз.

7 ПЦР - это ДНК-Технология714 октября 2012 г. Как задача постановки диагноза врачом решается сейчас Врач Осмотр Жалобы Микроскопия неокрашенного мазка Лаборатория Посев на флору Микроскопия окрашенных мазков По Граму Метиленовым синим ПЦР Качественная оценка условных патогенов

8 ПЦР - это ДНК-Технология814 октября 2012 г. Баквагиноз диагностика (1) На сегодняшний день в мире наибольшее распространение при диагностике баквагиноза получили критерии Амсела (Amsel criteria). Они включают четыре диагностических теста, которые могут быть выполнены в кабинете лечащего врача и лаборатории даже в присутствие пациента: патологический характер вагинальных выделений; рН вагинального отделяемого более 4,5; положительный аминный тест (появление "рыбного" запаха при смешивании выделений с определенным химическим веществом); выявление так называемых "ключевых" клеток при микроскопическом исследовании влажных неокрашенных препаратов вагинального отделяемого. Для постановки диагноза достаточно 3 положительных признаков из 4.

9 ПЦР - это ДНК-Технология914 октября 2012 г. Баквагиноз диагностика (2) На втором месте по распространенности находятся микроскопические методы с оценкой в баллах (напр., «Nugent scoring», «Hay/Ison scoring», «Schmidt scoring»). В качестве примера, слева приведена система Шмидта (Schmidt scoring). Баллы суммируются по двум колонкам; баквагиноз Баллы Число лактобактерий в поле Число «малых» бактерий в поле 0> >30

10 ПЦР - это ДНК-Технология1014 октября 2012 г. Сравнение мазок-посев (по данным собственных исследований) Данные лабораторных исследований% случаев Микроскопия окрашенного мазка, не выявившая клеток микроорганизмов 7,5 Микробиологические исследования с полным отсутствием роста микроорганизмов 14 Дискордантные результаты между микроскопическим и микробиологическим исследованием по наличию микроорганизмов разных групп (морфотипов) 29

11 ПЦР - это ДНК-Технология1114 октября 2012 г. Недостатки существующего подхода Посев на флору Длительные сроки культивирования, повышенные требования к транспортировке и хранению материала Не все типы микроорганизмов растут равномерно – в процессе роста теряется соотношение между ними Ограниченный спектр выявляемых микроорганизмов Отсутствие возможности культивирования большинства анаэробов Повышенные требования к лаборатории Микроскопия мазка Субъективность оценки (изменчивость микроорганизмов, необходимость диагностировать много морфотипов) Не все микроорганизмы видны в световой микроскоп Как следствие - ограниченный спектр выявляемых микроорганизмов Невозможность сопоставить результаты Приблизительная количественная оценка ПЦР качественными методами Не дает представления о соотношении микроорганизмов между собой Ограниченный спектр выявляемых микроорганизмов Нет количественной оценки

12 ПЦР - это ДНК-Технология1214 октября 2012 г. Чего мы хотим ? Диагностика баквагиноза или оценка биоценоза? Диагностика баквагиноза – «кто победил, хорошие или плохие?». Ответ типа «Да/Нет» - есть БВ или нет. Оценка биоценоза – количественная характеристика состава «хороших» и «плохих», оценка их «сил», устойчивости биоценоза.

13 ПЦР - это ДНК-Технология1314 октября 2012 г. Качественный ПЦР анализ Относительный количественный анализ: Анализ условно патогенной флоры с выраженным вагинитом здоровые женщины диагноз неустановлен Анализ 20-ти образцов, взятых с потока в лаборатории, с выявленной ДНК Gardnerella vaginalis

14 ПЦР - это ДНК-Технология1414 октября 2012 г. Анализ условно-патогенных микроорганизмов Врачу необходима информация о состоянии биоценоза в целом: Информация о соотношении общей обсемененности урогенитального тракта, лактобактерий и различных групп микроорганизмов является ключевой при оценке состояния биоценоза и, как следствие, состояния пациентки Важна количественная оценка групп микроорганизмов, что позволит оценивать динамические изменения состояния биоценоза

15 ПЦР - это ДНК-Технология1514 октября 2012 г. Подход к разработке диагностической системы По литературным данным более 100 различных видов микроорганизмов могут входить в состав биоценоза урогенитального тракта у женщин. Эти микроорганизмы можно сгруппировать по признаку генетического родства. Для выявления этих групп и были разработаны реагенты.

16 ПЦР - это ДНК-Технология1614 октября 2012 г. Что такое Фемофлор? Высококлассный метод для исследования урогенитального тракта у женщин, позволяющий анализировать состояние биоценоза в целом, оценивать соотношение микроорганизмов между собой. Многофакторный (23 группы микроорганизмов, общая бактериальная масса, контроль взятия материала. Итого: 25 показателей) Уникальный по составу выявляемых микроорганизмов Количественный Точный Высокая аналитическая чувствительность Высокая аналитическая специфичность Наглядный (ПО + выдача результатов) Быстрый и несложный в использовании (стандартные методики выделения ДНК и ПЦР амплификации) Наличие готовых файлов с программами для ДТ-96 – исключение ошибок и потери времени при программировании амплификатора

17 ПЦР - это ДНК-Технология1714 октября 2012 г. Состав комплектов реагентов Комплект реагентов позволяет количественно выявлять следующие группы показателей: Общую бактериальную массу Лактобактерии Аэробные микроорганизмы (факультативные анаэробы) Анаэробные микроорганизмы Микоплазмы Грибы Контроль взятия материала Контроль прохождения реакции

18 ПЦР - это ДНК-Технология1814 октября 2012 г. Состав комплектов реагентов ГруппаВыявляемые показатели Фемофлор 4 Фемофлор 8Фемофлор 16 Диагностика нормоценоза 1 Общая бактериальная масса 2 Lactobacillus spp. / ВК Аэробные микроорганизмы 3 Сем. Enterobacteriaceae 4 Streptococcus spp. 5 Staphylococcus spp. Анаэробные микроорганизмы 6 Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/ Porphyromonas spp. 7 Eubacterium spp. 8 Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp. 9 Megasphaera spp./Veilonella spp./Dialister spp. 10 Lachnobacterium spp./Clostridium spp. 11 Mobiluncus spp./Corynebacterium spp. 12 Peptostreptococcus spp. 13 Atopobium vaginae Группа Микоплазм 14 Mycoplasma (hominis +genitalium ) 15 Ureaplasma (urealyticum + parvum) Грибы 16 Candida spp./контроль взятия материала

19 ПЦР - это ДНК-Технология1914 октября 2012 г. Как это соотносится с уже имеющимися исследованиями (1) Исследование баквагиноза - критерий Нагента (Nugent scoring). Микроскопия окрашенного мазка. Оценка состояния идет по сумме балов. 0-3 нормальная вагинальная флора 4-6 промежуточное состояние 7-10 баквагиноз БаллыЛактобактерии в поле зрения Гарднерелла и бактероиды Палочк овая флора 030

20 ПЦР - это ДНК-Технология2014 октября 2012 г. Как это соотносится с уже имеющимися исследованиями (2) В качестве примера, слева приведена система Шмидта (Schmidt scoring). Микроскопия окрашенного мазка. Баллы суммируются по двум колонкам; баквагиноз Баллы Число лактобактерий в поле зрения Число «малых» бактерий в поле зрения 0> >30 Баквагиноз диагностируется при доле лактобактерий меньше 14%

21 ПЦР - это ДНК-Технология2114 октября 2012 г. Назначение комплектов реагентов (1) Фемофлор 16 Расширенная этиологическая диагностика условно- патогенной и нормофлоры (23 группы микроорганизмов) Количественная оценка общей бактериальной массы Количественная оценка лактобактерий (нормофлоры) Контроль взятия биологического материала Оценка эффективности проведенного лечения Подробный мониторинг восстановления нормоценоза

22 ПЦР - это ДНК-Технология2214 октября 2012 г. Назначение комплектов реагентов (2) Фемофлор 4 Диагностика наиболее распространенных микроорганизмов условно-патогенной флоры – 5 групп микроорганизмов Количественная оценка общей бактериальной массы и лактобактерий Контроль взятия биологического материала Контроль проведенного лечения Фемофлор 8 Расширенная диагностика микроорганизмов условно- патогенной флоры (9 групп микроорганизмов) Количественная оценка общей бактериальной массы и лактобактерий Контроль взятия биологического материала Контроль проведенного лечения

23 ПЦР - это ДНК-Технология2314 октября 2012 г. Количественное исследование В случае исследования биоценозов урогенитального тракта у женщин определяется количество микроорганизмов в транспортной среде, пропорциональное общей обсемененности соответствующего биотопа. Для исключения ложноотрицательных результатов предусмотрен контроль взятия материала. Интерпретации подлежат результаты со значением контроля взятия материала более 10 4 (4 Log). При КВМ менее 10 4 (4 Log) необходимо связаться с врачом для выяснения состояния пациента или дополнительно взять материал.

24 ПЦР - это ДНК-Технология2414 октября 2012 г. Контроль взятия материала Зависимость количества взятого материала от врача Синими и красными ромбами обозначены образцы, взятые разными врачами КВМ (контроль взятия материала) Общая бактериальная масса (Log)

25 ПЦР - это ДНК-Технология2514 октября 2012 г. Возможности настройки системы выдачи результатов 1.Изменение уровня отсечки ( Log) 2.Возможность анализировать результаты по отдельным группам организмов, выставляя индивидуальный уровень отсечки для каждого из них

26 ПЦР - это ДНК-Технология2614 октября 2012 г. Инновационность предлагаемого подхода (1): Чувствительный «инструмент» с возможностью настройки под решаемую задачу, обследуемую группу пациентов, конкретного врача Возможность количественной оценки различных групп микроорганизмов и выявление соотношений между ними Выявление труднокультивируемых облигатно-анаэробных грамположительных бактерий (Atopobium vaginae), облигатно- анаэробных грамотрицательных бактерий (Prevotella, Veilonella spp, Porphyromonas spp, Fusobacterium spp, Eubacterium spp, Sneathia, Leptotrichia, Megasphaera, Dialister, Lachnobacterium) Выявление групп микроорганизмов, диагностика которых методом ПЦР до сих пор не была представлена Возможность проведения динамических наблюдений Возможность проведения научных исследований (в том числе и популяционных)

27 ПЦР - это ДНК-Технология2714 октября 2012 г. Инновационность предлагаемого подхода (2): 25 параметров анализа (для Фемофлор 16) Контроль взятия материала Исследование нормофлоры Количественное исследование всех параметров Программное обеспечение, максимально облегчающее работу врача лаборанта: отчет о проведенном исследовании выдается программой в доступной для анализа врача-клинициста форме готовый файл загрузки (Фемофлор.ini) с программой амплификации, что существенно экономит время и исключает ошибки ручного программирования прибора (ДТ-96) определение положения стрипа в термоблоке, позволяющее исправить допущенные ошибки при установке стрипов

28 ПЦР - это ДНК-Технология2814 октября 2012 г. Оборудование и программное обеспечение Детектирующий термоциклер ДТ-96, «ДНК-Технология»

29 ПЦР - это ДНК-Технология2914 октября 2012 г. Апробация реагентов прошла в следующих лабораториях: 1.НИИ Акушерства и гинекологии им. Отта (СПБ) 2.ЦНИИА и Г им. Кулакова (Москва) 3.Центр новых мед технологий (Новосибирск) 4.ДНК-Диагностика (Барнаул) 5.ДЦ (Бийск) 6.Ассоциация независимых клинико-диагностических лабораторий «Ситилаб» (Казань) 7.УРНИИ Дерматовенерологии (Екатеринбург) 8.ДЦ Гармония (Екатеринбург)

30 ПЦР - это ДНК-Технология3014 октября 2012 г. Дополнительные лабораторные исследования: Medicus Amicus #2, 2006, Исследование мазка на лейкоциты Качественный ПЦР анализ на безусловные патогены (хламидия, гонорея, трихомонас)

31 ПЦР - это ДНК-Технология3114 октября 2012 г. Исследование популяционной выборки (ПЦР, посев, мазок). Показатель Выявляемость разных групп микроорганизмов (%).ФемофлорМазокПосев Бактериальная масса нормофлора – Lactobacillus spp Enterobacterium spp.8не выявлено10 Streptococcus spp.12не выявлено13 Staphylococcus spp.19не выявлено43 Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp.46не выявлено3 Eubacterium spp.47не выявлено Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp.12не выявлено Megasphaera spp./Veilonella spp./Dialister spp.30не выявлено Lachnobacterium spp./Clostridium spp.15не выявлено Mobiluncus spp./Corynebacterium spp Peptostreptococcus spp.26не выявлено Atopobium vaginae18не выявлено Mycoplasma spp.3не выявлено Ureaplasma spp.28не выявлено Candida spp.3не выявлено4 Всего образцов: 100% образцов

32 ПЦР - это ДНК-Технология3214 октября 2012 г. Отзывы клиентов: «У пациенток с жалобами на выделения из влагалища целесообразно проводить скрининговое исследование состояния урогенитального биоценоза методом количественной Real-Time PCR «ФЕМОФЛОР 16» «С помощью методов генодиагностики возможно выявление труднокультивируемых облигатно-анаэробных грамположительных бактерий (Atopobium vaginae), облигатно-анаэробных грамотрицательных бактерий (Prevotella, Veilonella spp, Porphyromonas spp, Fusobacterium spp, Eubacterium spp, Sneathia, Leptotrichia, Megasphera, Dialister, Lachnobacterium), мониторинг эффективности лечения» УРНИИДВ (Екатеринбург) «Тест-система Фемофлор-16 является чувствительным инструментом для исследования биоценоза влагалища беременных женщин, позволяя выявлять как выраженные отклонения от нормы, так и только намечающиеся.» ДЦ Гармония (Екатеринбург)

33 ПЦР - это ДНК-Технология3314 октября 2012 г. Примеры результатов проведенных исследований (1) Нормоценоз Состояние нормоценоза характеризуется следующими показателями: Контроль взятия материала (КВМ) >10 4 (4 Log) Общая бакмасса от 10 6 до 10 9 (6-9 Log) Нормофлора от 10 6 до 10 9 (6-9 Log) относительно ОБМ – от 0-до 0,5 – нормальный уровень Аэробная и анаэробная условно-патогенная флора относительно ОБМ меньше 3 – нормальный уровень Микоплазмы: Mycoplasma (hominis + genitalium) – отсутствуют; Уреаплазмы: больше 10 4 диагностически значимый уровень Грибы рода Candida. Менее 10 3 (

34 ПЦР - это ДНК-Технология3414 октября 2012 г. Примеры результатов проведенных исследований (2) Умеренный дисбаланс Состояние умеренного дисбаланса характеризуется следующими показателями: Контроль взятия материала (КВМ) >10 4 (4 Log) Общая бакмасса от 10 6 до 10 9 (6-9 Log) Нормофлора (Lactobacillus spp.) 0-0,5 относительно ОБМ – нормальный уровень Аэробная и анаэробная условно- патогенная флора Больше -1 – значительно увеличенный уровень. Микоплазмы: отсутствуют; Уреаплазмы: Ureaplasma (urealiticum + parvum) больше диагностически значимый уровень. Грибы рода Candida. Менее 10 3 (

35 ПЦР - это ДНК-Технология3514 октября 2012 г. Примеры результатов проведенных исследований (3) Выраженный дисбаланс Состояние выраженного дисбаланса характеризуется следующими показателями: Контроль взятия материала (КВМ) >10 4 (4 Log) Общая бакмасса может иметь нормальный, повышенный или пониженный уровень. Нормофлора (Lactobacillus spp.) – относительно ОБМ - значительно сниженный уровень Аэробная и анаэробная условно-патогенная флора отличается разнообразием микроорганизмов. Доля большей части представителей условно-патогенной микрофлоры превышает долю лактобактерий в общей бактериальной массе. Значительно повышенный уровень. Микоплазмы: Mycoplasma (hominis + genitalium) – могут присутствовать в диагностически значимых количествах. Уреаплазмы: Ureaplasma (urealiticum + parvum) могут присутствовать в диагностически значимых количествах. Грибы рода Candida. присутствие более 10 3 (>3 Log) – диагностически значимый уровень.

36 ПЦР - это ДНК-Технология3614 октября 2012 г. Оценка состояния биоценоза (примеры) 37 лет, жалоб нет, здорова 27 лет, жалобы, пенистые выделения 23 года, прием оральных контрацептивов, жалоб нет, по мнению врача - здорова

37 Возникающие в процессе работы вопросы

38 ПЦР - это ДНК-Технология3814 октября 2012 г. Выдача результатов 1

39 ПЦР - это ДНК-Технология3914 октября 2012 г. Выдача результатов 2

40 ПЦР - это ДНК-Технология4014 октября 2012 г. Выдача результатов 3

41 ПЦР - это ДНК-Технология4114 октября 2012 г. Что такое логарифмы? числоlg

42 ПЦР - это ДНК-Технология4214 октября 2012 г. Что такое логарифмы? 2 Числоlg ,1 1582,2 2002,3 2512,4 3162,5 3982,6 5012,7 6312,8 7942,

43 ПЦР - это ДНК-Технология4314 октября 2012 г. Что нам с этим делать? 1.Думать 2.Еще раз думать 3.Грамотно брать материал 4.Проводить дополнительные анализы 5.Работать в тесном контакте с клиницистами 6. tech.ru/information/fordoctors/diagnosticsippp/ tech.ru/information/fordoctors/diagnosticsippp

44 ПЦР - это ДНК-Технология4414 октября 2012 г. Что с этим делают другие? Исследования биоценозов урогенитального тракта женщин репродуктивного возраста Жалобы без клинических проявлений (U,V,C) Случаи несовпадения клиники и лабораторных исследований Повторные обращения после лечения Оценка эффективности ЭКО Оценка эффективности проведенного лечения Оценка восстановления нормофлоры Проблемы с невынашиванием беременности Исследования биоценозов беременных женщин Оценка объема предполагаемой терапии Исследования биоценозов женщин в менопаузе

45 ПЦР - это ДНК-Технология4514 октября 2012 г. Группы обследованных женщин Не беременные женщины репродуктивного возраста (67 пациенток в возрасте от 19 до 49 лет, 32 года) Клинически здоровые Патологические проявления Воспалительные процессы Женщины в менопаузе ( 33 пациентки в возрасте от 41 до 73 лет, 53,3 года) Физиологическая норма Сухость слизистой

46 ПЦР - это ДНК-Технология4614 октября 2012 г. Общая бактериальная масса в подгруппах женщин в менопаузе по сравнению с реподуктивной нормой 2а – менопауза, норма 2б – менопауза, сухость

47 ПЦР - это ДНК-Технология4714 октября 2012 г. Лактобактерии в подгруппах женщин в менопаузе по сравнению с реподуктивной нормой 2а – менопауза, норма 2б – менопауза, сухость

48 ПЦР - это ДНК-Технология4814 октября 2012 г. Группа женщин репродуктивного возраста «Норма» Общая бак.масса 10 6,5 (10 5, ,8 ) ГЭ Лактобациллы 10 6,1 (10 5, ,6 ) ГЭ Доля лактобацилл 78 (50-79)% Доля Gardnerella 0,1 (0-6,3)% «Патология» Общая бак.масса 10 7,2 (10 6, ,6 ) ГЭ Лактобациллы 10 4,3 (10 2, ,6 ) ГЭ Доля лактобацилл 0,8% ((0-37,6)) Доля Gardnerella 15,8% (9,0-29,9) Eubacterium spp. (p=0,000091), Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp. (p=0,000018), Peptostreptococcus spp. (p=0,0008), Atopobium vaginae (p=0,003).

49 ПЦР - это ДНК-Технология4914 октября 2012 г. Группа женщин в менопаузе «Норма» Общая бак.масса 10 6,5 (10 5, ,1 ) ГЭ Лактобациллы 10 4,4 (10 1, ,5 ) ГЭ Доля лактобацилл 3 (0-56)% Доля Gardnerella 18 (0-32)% «Патология» (сухость слизистой) Общая бак.масса 10 5,0 (10 4, ,3 ) ГЭ Лактобациллы 10 2,6 (10 0, ,3 ) ГЭ Доля лактобацилл 7 (0-12)% Доля Gardnerella 12 (3-30)%

50 ПЦР - это ДНК-Технология5014 октября 2012 г. Выводы: С помощью реагентов Фемофлор был количественно охарактеризован биоценоз влагалища женщин репродуктивного возраста и женщин в менопаузе. В группе женщин репродуктивного возраста показаны достоверные различия в количестве общей бактериальной массы между пациентками с дисбиозом влагалища и клинически здоровыми. Кроме того, показан выраженный рост общей бактериальной массы на фоне снижения доли лактобацилл и увеличения доли анаэробных микроорганизмов при развитии дисбиотических нарушений. Для женщин в менопаузе было продемонстрировано, что снижение общей бактериальной массы и доли лактобацилл, по- видимому, является физиологически нормальным процессом для этой группы.

51 Спасибо за внимание!

52 Справочно:

53 ПЦР - это ДНК-Технология5314 октября 2012 г. Описание: Комплектация: Фемофлор 16 – 12 тестов (по 2 стрипа каждый) в упаковке Фемофлор 8 – 24 теста (по 1 стрипу на тест) в упаковке Фемофлор 4 – 48 тестов (2 теста на стрип)в упаковке Рекомендуемые системы выделения (в комплект поставки не входят): «Проба НК» «Проба ГС» Срок хранения – 6 месяцев Температура хранения +2 +8ºС Условия транспортировки 72 часа при температуре от +18 до +25ºС

54 ПЦР - это ДНК-Технология5414 октября 2012 г. Что предлагаемый анализ дает врачу: Оценка биоценоза в целом Современные методы диагностики Данный анализ более информативен, т.к. позволяет проводить сравнение количества бактериальной массы с лактобактериями – определение объема назначаемой терапии Данный анализ выявляет многие микроорганизмы, которые не видны в микроскоп или не растут на питательных средах – определение этиологии инфекционного процесса Возможность проведения динамических наблюдений По сравнению с посевом на питательные среды (срок исполнения 5 дней) этот анализ гораздо быстрее - результаты могут быть получены в течение суток

55 ПЦР - это ДНК-Технология5514 октября 2012 г. Немного цифр Итого: 16 –24 дней 1700 – 2800 руб. Время, дни Схема лечения Деньги, руб. Анализы1- 5 дней руб. Стандартная схема лечения 7 днейТрихопол Нео-Пенатран руб. Анализы1-5 дней400 – 800 руб. Дополнительн ая схема лечения 7 днейОрнидазол Бетадин Микосист руб.

56 ПЦР - это ДНК-Технология5614 октября 2012 г. Что анализ дает пациенту Полная и информативная диагностика за 1 визит к врачу Данный анализ позволит пациенту избежать избыточного лечения (гиперпрагмазии) Индивидуально подобранная терапия для каждого пациента Возможность контролировать проведенное лечение и восстановление нормальной флоры Стоимость количественного определения каждого из показателей сопоставима (или даже меньше), чем стоимость неинформативного в данном случае качественного анализа методом ПЦР

57 ПЦР - это ДНК-Технология5714 октября 2012 г. Проблемы диагностики заболеваний, связанных с условными патогенами Существующие в настоящее время подходы к диагностике условно- патогенной флоры не всегда информативны для врача, т.к. Не дают представления о соотношении микроорганизмов, составляющих биоценоз, между собой Выявляют ограниченный спектр микроорганизмов Не дают количественной оценки

58 ПЦР - это ДНК-Технология5814 октября 2012 г. Дополнительно: Выявление Atopobium vaginae регламентировано приказом МЗ РФ N 64 от 21 февраля 2000 г. Раздел микробиологические исследования условно-патогенные облигатные анаэробные микроорганизмы.

59 ПЦР - это ДНК-Технология5914 октября 2012 г. Сравнение методов 1.Врачам достаточно того, что есть сейчас – микроскопии окрашенного мазка и посева на питательные среды Каждый 7 бак.посев не вырастает Каждый 12 мазок не информативен 19 из 23 показателей выявляются неадекватно или вообще не выявляются при помощи мазка или посева Количественная оценка по данным мазка или посева проводится очень приблизительно Результат мазка зависит от квалификации врача- лаборанта Результат посева – от качества используемых сред, работы лаборатории, квалификации врача-лаборанта В процессе роста микроорганизмов на среде теряется соотношение между ними

60 ПЦР - это ДНК-Технология6014 октября 2012 г. Сравнение методов (2) 2. На рынке уже есть реагенты для выявления условных патогенов методом ПЦР В большинстве случаев эти реагенты позволяют проводить только качественный анализ, который не может быть информативен для врача (важно знать не только качественный, но и количественный состав микробиоты) Нет реагентов, позволяющих проводить сравнение количеств условно-патогенных микроорганизмов с лактобактериями Нет реагентов, которые позволяли бы проводить количественную оценку такого числа (23 группы) условно- патогенных микроорганизмов урогенитального тракта

61 ПЦР - это ДНК-Технология6114 октября 2012 г. Как выглядит К+?

62 ПЦР - это ДНК-Технология6214 октября 2012 г. Как выглядит К-?

63 ПЦР - это ДНК-Технология6314 октября 2012 г. Артефакты

64 ПЦР - это ДНК-Технология6414 октября 2012 г. Артефакты 2

65 ПЦР - это ДНК-Технология6514 октября 2012 г. Литература по теме (1) Анкирская А.С., Муравьева В.В. Опыт микробиологической диагностики оппортунистических инфекций влагалища. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерпия., 2001, т.3, 2, с Бодяжина В.И., Сметник В.П., Тумилович Л.Г. Неоперативная гинекология: Руководство для врачей. – М.: Медицина, – 540с. Василевская Л.Н., Грищенко В.И., Кобзева Н.В., Юровская В.П. Гинекология: учебник, - М., Медицина, Дмитриев Г.А. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций. – М.:Медицинская книга; Н.Новгород: Издательство НГМА, – 336с. Кира Е.Ф Клиника и диагностика бактериального вагиноза // Акушерство и гинекология, 2, С Кисина В.И., Клинико-диагностические аспекты и лечение вагинальных инфекций // Венерические болезни Том – С Коршунов В. М., Володин Н. Н., Ефимов Б. А., Саркисов С. Э. и др. Микроэкология влагалища. Коррекция микрофлоры при вагинальных дисбактериозах, Москва. – – 80с.

66 ПЦР - это ДНК-Технология6614 октября 2012 г. Литература по теме (2) Кубанова А. А., Аковбян В. А., Федоров С. М., Бакалова Л. А., Халатов А. О. Состояние проблемы бактериального вагиноза // Вестник дермат. и венерол С. 22–26. Методическиe указания МУ Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности, Москва. – Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно- профилактических учреждений. Приказ МЗ СССР 535 от Brotman RM, Erbelding EJ, Jamshidi RM, et al. Findings associated with recurrence of bacterial vaginosis among adolescents attending sexually transmitted diseases clinics. J Pediatr Adolesc Gynecol Aug;20(4): Ferris MJ, Masztal A, Aldridge KE. et al. Association of Atopobium vaginae, a recently described metronidazole resistant anaerobe, with bacterial vaginosis. BMC Infect Dis Feb 13;4:5. French JI, McGregor JA, Draper D et al. Gestational bleeding, bacterial vaginosis, and common reproductive tract infections: risk for preterm birth and benefit of treatment. Obstet Gynecol May;93(5 Pt 1): Hager WD, McDaniel PS Treatment of serious obstetric and gynecologic infections with cefoxitin. J Reprod Med May;28(5):

67 ПЦР - это ДНК-Технология6714 октября 2012 г. Литература по теме (3) Hashemi FB, Ghassemi M, Roebuck KA, Spear GT Activation of human immunodeficiency virus type 1 expression by Gardnerella vaginalis. J Infect Dis Apr;179(4): Klebanoff M.A., Schwebke JR, Zhang J et al. Vulvovaginal symptoms in women with bacterial vaginosis. Obstet Gynecol, 2004; 104: Larsson PG, Carlsson B. Does pre- and postoperative metronidazole treatment lower vaginal cuff infection rate after abdominal hysterectomy among women with bacterial vaginosis? Infect Dis Obstet Gynecol. 2002;10(3): Leitich H, Bodner-Adler B, Brunbauer M, Kaider A, Egarter C, Husslein P. Bacterial vaginosis as a risk factor for preterm delivery: a meta-analysis. Am J Obstet Gynecol Jul;189(1): Mead P. B. Epidemiology of bacterial vaginosis // Am. J. Obstet. Gynecol Vol.169, N.2, pt.2. – P Mullis KB. Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann Biol Clin (Paris). 1990;48(8): Nugent RP, Krohn MA, Hillier SL Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation. J Clin Microbiol Feb;29(2):

68 ПЦР - это ДНК-Технология6814 октября 2012 г. Использованная литература (4) Paneth NS.The problem of low birth weight.. Future Child Spring;5(1): Schwiertz A, Taras D, Rusch K, Rusch V. Throwing the dice for the diagnosis of vaginal complaints? Ann Clin Microbiol Antimicrob Feb 17;5:4, 1-7 Sewankambo N, Gray RH, Wawer MJ et al,.HIV-1 infection associated with abnormal vaginal flora morphology and bacterial vaginosis. Lancet Aug 23;350(9077): Sha BE, Zariffard MR, Wang QJ et al. Female genital-tract HIV load correlates inversely with Lactobacillus species but positively with bacterial vaginosis and Mycoplasma hominis. J Infect Dis Jan 1;191(1): Epub 2004 Dec 2 Wiesenfeld HC.;Hillier, Sharon L.;et al. Bacterial vaginosis is a strong predictor of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection. Clin Infect Dis Mar 1;36(5):663–66 Zhou X, Bent SJ, Schneider MG et aal Characterization of vaginal microbial communities in adult healthy women using cultivation-independent methods. Microbiology Aug;150(Pt 8):